DREAMによるカルシトニン遺伝子の転写機構の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12877298
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 平田 雅人 九州大学, 歯学研究院, 教授 (60136471)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹内 弘 九州大学, 歯学研究院, 助手 (70304813) ; 兼松 隆 九州大学, 歯学研究院, 助教授 (10264053)
• Keywords: カルシトニン / 転写因子 / カルシウム / EFハンドモチーフ / 甲状腺

Research Abstract

ヒト脳mRNAよりRT-PCR法にてDREAM/calsenilin cDNAのクローニングを行った。得られたcDNAをもとにDREAMの野生型、及びC末端側に存在するCa2+結合モチーフ(EF-ハンド)に点変異を与えた変異型、それぞれの大腸菌発現系を構築し両組み換え蛋白質を発現、精製した。調製した蛋白質とCa2+との結合能を45Ca2+オーバーレイ法を用いて確認した。野生型DREAMは、Ca2+と結合したが、変異体では結合は見られなかった。次にプロダイノルフィン遺伝子上に存在するDRE配列と調製したDREAMとの結合をEMSA法によりCa2+濃度を変えて検討した。野生型DREAMでは高Ca2+濃度下でDRE配列との結合が見られなくなったが、変異型ではDRE配列に結合したままであった。以上より調製したDREAM蛋白質とDNAのDRE配列との結合がEF-ハンドへのカルシウム結合能に依存することが確認できた。
次に甲状腺髄様癌由来の細胞株(TT cell)を用いてカルシトニン(CT)分泌調節へのDREAMの関与を調べた。RT-PCR法でTT cellがDREAMを内在性に発現していることを確認した。このTT cellに野生型及び変異型DREAMの哺乳類細胞発現ベクターさらに、DREAMのセンスおよびアンチセンスmRNAを発現するベクターも構築し、それぞれでTT細胞を形質変換した。発現したDREAMは細胞内で均一に分布していた。アンチセンスを発現させた細胞においては対照細胞やセンス発現細胞と比較してDREAMの発現抑制が認められたとともにA23187刺激によるCT分泌量が低下していた。また、変異型DREAMを導入したTT細胞でもCT分泌が減少した。これらのことから、甲状腺でのCTの発現、分泌にDREAMが関わっていることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Yamamoto,T.: "Involvement of EF hand motifs in the Ca^<2+>-dependent binding of the pleckstrin homology domain to phosphoinositides"Eur.J.Biochem.. 265. 481-490 (1999)
• [Publications] Takeuchi,H.: "Inhibition of calcium signalling by p130,PLC-related catalytically inactive protein : critical role of the p130PH domain"Biochem.J.. 349. 357-368 (2000)
• [Publications] Hermosura,M.C.: "InsP_4 facilitates store-operated calcium influx by inhibition of InsP_3 5-phosphatase"Nature. 408. 735-740 (2000)