2013 Fiscal Year Annual Research Report
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12J01936
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
李 紅梅 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(DC)
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| Keywords | iPS細胞 / 遺伝子改変 / TALEN / CRISPR |
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| Research Abstract |
本研究では、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)患者由来iPS細胞において、TALENやCRISPRなどの人工ヌクレアーゼを用いたジストロフィン遺伝子をゲノム上で修復することで、機能性ジストロフィンを回復させることを目的としている。これまでに私は、DMD-ips細胞において機能性ジストロフィンを回復させるために、以下のような実験を検討してきた。
1. TALENs発現ベクターの構築と細胞導入。ジストロフィン遺伝子のエクソン45の開始点部分に, いくつかのTALENとCRISPRのガイドRNAをデザインし、それらの発現ベクターを構築した。TALENやCRISPRの切断によるルシフェラーゼ活性の回復を利用したSSAアッセイを用いて、TALENとCRISPRの切断活性を確認した。また、DMD-ips細胞にエレクトロポレーション法であるNEPA21を用い、導入効率の条件検討を行った。
2. TALENsのゲノム上ターゲットサイトへの変異導入効率解析。TALEN切断部位に存在する制限酵素による切断解析を行い、約15-25%の変異導入効率を得ることができた。さらに変異導入傾向を確認するため、次世代シーケンス解析を行い、さまざまな長さの欠損および挿入が確認された。
3. ジストロフィン修復した細胞のクローン化と骨格筋細胞への分化。TALENによるジストロフィンタンパク質のフレームが回復しているクローンとTALENやCRISPRを鋳型と共導入でエクソン44ノックインしたクローンの樹立に成功した。これらのクローンをDox誘導型MyoD発現の分化方法を用いて、骨格筋細胞に分化させ、最終的にジストロフィンmRNA及びタンパク質の発現が確認できた。
これまでの結果を踏まえて、TALENまたはCRISPR-Cas9を用いた遺伝子改変はフレームシフトとノックインの二つのアプローチによるジストロフィン遺伝子異常の回復が可能であることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
博士課程の最後一年は論文がまとめるように実験を計画して来た。これまでの結果は研究室メンバーの普段のサポートと共同研究者の協力のもとで進めてきた。指導教員である山中伸弥教授の指導と直接指導していただいている堀田秋津助教授の日々のアドバイスとディスカションも結果に欠かせないことです。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずこれまで行ってきた実験と得られた結果を学位論文にまとめて行きたい。さらに、新たなTALENやCRISPR-Cas9の特異性の検定方法の開発を行って行きたい。
1. 新たなTALENやCRISPR-Cas9の特異性の検定方法の開発
新たなTALENの特異性を解析する方法も試みている。TALENのターゲットサイトを含む大きく2種類のライブラリーを構築する。一つ目はTALENターゲットサイトのスペーサーの長さを調節した配列のライブラリー。二つ目はTALEN認識サイトに1もしくは2塩基のミスマッチを導入した配列ライブラリー。
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Research Products
(7 results)
