2013 Fiscal Year Annual Research Report
新奇スフィンゴ糖脂質分解酵素群を利用した糖脂質代謝機構の解明及び創薬への応用
| Project/Area Number |
12J03574
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
澄田 智美 独立行政法人理化学研究所, 横山構造生物学研究室, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Keywords | スフィンゴ糖脂質 / 糖質分解酵素 / ガングリオシド / グリコシダーゼ / 結晶構造解析 |
|---|
| Research Abstract |
スフィンゴ糖脂質の代謝に関わる酵素の基質認識の詳細な解析は、スフィンゴ糖脂質代謝異常症の治療薬の開発に対する基礎的研究となる。本研究では糖脂質に作用する微生物由来の新規グリコシダーゼ群を用いて、糖脂質の認識メカニズムの解明を行い、スフィンゴ糖脂質代謝異常症の治療薬開発に対して新しい情報を提供することを目的としている。昨年度は、本酵素のうちG4Tが糖脂質に作用することを突き止めた。今年度はG4Tの変異体酵素を作成することにより、糖脂質認識メカニズムの詳細な解明を行った。推定二次配列情報より、本酵素には既報の酵素とは異なるドメイン配列が存在したため、それらのドメインを除いたdeletion mutantを作成し、糖脂質に対する活性を調べた。その結果、本酵素特有のドメインを削ることにより、糖脂質に対する活性が低下したため、それらの配列が糖脂質の認識に関わっていることがわかった。また、スフィンゴ糖脂質からセラミド部分を除いた糖鎖部分のみを精製し、そのオリゴ糖鎖に対する本酵素の活性も調べた。非常に興味深いことに、本酵素はオリゴ糖よりも糖脂質により強い活性を示した。さらに本酵素の酸/塩基触媒残基と求核性触媒残基と推定される酸性アミノ酸に変異を入れた変異体を作製し、活性測定を行ったところ、活性の低下が確認できたため、本酵素の触媒残基を同定した。また、本年度は新規グリコシダーゼであるNgaPの諸性質の検討に関するポスター発表を日本糖質学会で行ったところ、本酵素の新規性、重要性が認められ、ポスター賞を受賞することができた。昨年度より引き続きG4T, NgaP等の新規酵素の結晶化スクリーニングを行っているが現在までに構造解析可能な単結晶は得られていない。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
糖脂質代謝機構の解明に関しては、deletion mutant,点変異体等の作製を行い、非常に興味深い結果を得ることができた。糖脂質に対する活性および、オリゴ糖に対する活性の比較を行い、論文化に向けてデータをまとめはじめている。結晶構造解析においてはコンストラクト、精製条件の変更、複合体での結晶化等、さらなる結晶化スクリーニングを行ったが、残念ながら結晶は得られていないため、当初の計画よりやや遅れた達成度となっている。Paenibacillus sp. TS12由来の酵素は非常に不安定なため、精製条件やコンストラクトを変更したが、時間経過とともに活性が低下していく不安定な酵素だということもわかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題は糖脂質代謝機構の解明及び創薬への応用であるが、糖脂質代謝機構の解明としては、本酵素のG4Tで糖鎖よりも糖脂質により作用しやすいという結果を得られたので、その認識メカニズムを明らかにし、論文にまとめて成果報告を行う予定である。創薬への応用に関しては、対象としていたホモログ酵素の哺乳類由来の酵素の構造解析の論文が発表された。それら構造情報を利用して世界的にケミカルシャペロンとなりうる化合物の探索が進められている。そこで、ホモログ酵素の構造解析の優先順位を下げ、現在は新規ファミリーの酵素であるNgaPおよび特徴的ドメインを持つG4Tの結晶化を行っている。糖脂質に作用するより多くの酵素の構造解析情報を報告し、糖脂質代謝異常症の治療薬開発への情報提供を行うことを目的とする。しかし、対象酵素は、配列相同性のある他の酵素に比べても配列が倍近く長く、また、性質が不安定で、低温でも活性が低下していく。本酵素をいかに安定な状態で精製するか、様々な条件を検討中である。さらなるコンストラクトの変更、精製条件の検討等行い、より安定に酵素を精製できる条件を探索していく。
|
Research Products
(1 results)
