BMP－Neogeninシグナルによる、中枢神経系のシナプス安定化・除去機構解明

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12J04239
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 萩原 芽子 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Keywords: シナプス安定化 / 骨形成因子(BMP) / neogenin

Research Abstract

In vitroの実験系を中心として、胎生マウス脳の初代培養大脳皮質神経細胞を使って、BMPシグナルによる神経細胞の形態変化を解析した。BMP-4添加後、時間経過を追って観察したが、軸策の長さ、樹状突起の数、シナプス形成に有意な差は認められなかった。BMPのアンタニゴストであるchordinノックアウトマウスの実験やBMP-4ノックアウトマウスの小脳の実験では、シナプス形成後のシナプス安定化やシナプス除去にBMP-4が関与する可能性を報告している。そこで、培養神経細胞の長期培養後のBMP-4のシナプスへの関与を評価した。シナプスの安定化を評価するために、長期培養後の神経細胞にGFPを遺伝子導入し、スパインの形態及び、軸策にできる小突起の形態を免疫染色法、シナプスマーカーであるPSD-95やsynapsin Iをwestem-blotting法で解析した。また、BMPシグナルへのneogeninの制御を解析するために、培養神経細胞にneogenin siRNAを遺伝子導入した。
In vivoの実験系として、neogenin siRNAを生後3日目のマウス大脳皮質に注入し、Neogeninの発現が低下していることを確認した。そこで、トレーサーを用いて、生後7日目の皮質脊髄路の形態を解析した。また、大脳皮質の細胞体が細胞死を起こしている可能性を考え、染色した。
さらに、neogeninノックアウトマウスの解析も行っている。neogeninノックアウトマウスは生後30日前後で致死することが報告されており、生後発達段階において、何らかの異常が起きている事が考えられる。そこで、生後発達段階の中枢神経系に着目する。neogeninノックアウトマウスの行動には著しい異常は観察されなかった。組織学解析では、大脳皮質や内包、脊髄の凍結切片を作成し、皮質脊髄路のマーカーとして知られるPKCγや申請細胞軸策のマーカーであるtuji1を傾向免疫染色法にて検出した。今後は大脳皮質よりトレーサーを注入して、皮質脊髄路を解析する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Neogeninノックダウンに用いるNeogenin siRNA注入時に大脳皮質の細胞体に直接siRNAやトレーサーを注入する技術の習得が難しく、また条件検討に時間を要した。また、Neogeninノックアウトマウスの解析には予定より早く取りかかれているが、マウスが生後30日にまでに多数死亡してしまうことや、受胎が難しく、検体数の確保が十分でないことにより、中枢神経の発生段階におけるneogeninの機能解析を遅らせている。

Strategy for Future Research Activity

大脳皮質及び、脊髄の皮質脊髄路において、発生段階における顕著なneogeninの発現量変化を観察したため、シナプスの安定性と関連があると考えられる神経細胞軸策の維持を解析する。それに伴い、軸策が安定すれば、シナプスの安定が引き起こされることも明らかにする必要があるため、in vitroにおいて、大脳皮質初代培養神経細胞を用いて、シナプスの安定化と軸策の安定化の相対比較を行う。
Neogeninノックアウトマウスの実験では、胎生期よりneogeninの発現量が抑制されているため、皮質脊髄路の神経細胞軸策形成の段階でneogeninが働いている可能性も考えられる。コンディショナルノックアウトマウスを作成するか、neogeninsiRNAを注入する時期を操作して、軸策の安定化を評価する必要がある。
また、neogenin強制発現系の実験をする必要があるが、neogeninは単独で、細胞を細胞死へ誘導することが報告されているため、BMPシグナルとの関与が解析できない。よって、neogeninのノックダウン系に頼った証明方法を考える必要がある。