弾性線維維持・再生におけるDANCEの役割の研究

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12J40147
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 東 淳子 関西医科大学, 医学部, 特別研究員(RPD)
• Keywords: DANCE / 弾性線維 / CreERT2 / 老化関連疾患

Research Abstract

弾性線維の劣化は肺気腫等の老化関連疾患の原因と考えられているが、その維持機構については不明な点が多い。胎生期の弾性線維形成に必須であるDANCEは、成体期にも高いレベルで発現し加齢に伴い組織のDANCEの活性が低下していることから、成体期における弾性線維の維持に関わっていることが推測されていたが、従来のDANCEノックアウトマウスでは胎児期の弾性線維形成に異常があるために検証は困難であった。そこで申請者はCreERT2システムを利用して弾性線維形成の終了した成体期にDANCEの発現を抑制し、実際に弾性線維の劣化が進むかどうかを検証する計画を立てた。
平成24年度は、DANCEの遺伝子座にCreERT2をノックインしたマウス(ノックインマウス)とDANCE遺伝子の一部をloxPではさんだ(flox)マウスを作成した。
まず、生体でのCreERT2の蛋白の発現効率を上げるために、ほ乳類のコドン使用頻度に応じてCre遺伝子配列を設計(最適化)し、クローニングした。ほ乳類最適化配列と従来のファージ由来配列のCreERT2の発現効率を細胞実験で比較したところ、最適化配列の方が発現量は上昇していたため、マウス作成にあたり、ほ乳類最適化配列を採用することにした。
次にノックインマウスとfloxマウスのターゲティングベクターをBACの大腸菌内組換え(recombineering)技術を用いて作成し、ES細胞を樹立した。DANCEfloxマウスでは良好なキメラマウスからF1マウスを得た。F1マウスはまず全身でCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配し、ノックアウトマウスと同様の表現型を呈することを確認した。ノックインマウスも良好なキメラマウスを複数得られ、現在はF1マウスを得るために野生型と交配している最中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成24年度は2系統の遺伝子改変マウスを作成する研究計画をとっており、申請者はDANCE-CreERT2ノックインマウスではキメラマウスの確保、DANCE-floxマウスではF1マウスの確保と組み替えによるDANCEの発現の停止を確認するところまで到達した。

Strategy for Future Research Activity

今後、FRT配列ではさんだpgk-Neoカセットを、生殖系列でFRTを発現するマウスと掛け合わせることにより除去する。その上で、DANCE-CreERT2ノックインマウスとインディケーターマウスを交配し、CreERT2の発現部位がDANCEの発現部位と一致するかを確認する。更に、DANCE-CreERT2ノックインマウスとDANCE floxマウスを交配し、成体期に誘導薬剤であるタモキシフェンを投与することで、DANCEの発現を停止させ、弾性線維の劣化の状態を弾性線維が重要な働きをしている臓器(皮膚・大動脈・肺)で評価する。