2012 Fiscal Year Annual Research Report

オートファジーの始動を制御するATG1キナーゼ複合体の分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number	12J40279
Research Institution	Microbial Chemistry Research Foundation
Principal Investigator	藤岡優子公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 特別研究員(RPD)
Keywords	オートファジー / プロテインキナーゼ / 結晶構造解析 / Atg1 / Atg13
Research Abstract	本研究は、オートファジーの進行に必要なプロテインキナーゼAtg1とAtg13との複合体と、その複合体に結合することによってAtg1の活性化に寄与するAtg17-Atg29-Atg31の3者複合体、さらにはAtg1-Atg13-Atg17-Atg29-Atg31の5者複合体の立体構造解析を行うことによって、その相互作用様式を明らかにし、Atg1のキナーゼ活性の調節メカニズムを解明することを目的としている。・Atg1-Atg13複合体の結晶構造解析についてドメイン解析により複合体形成に必要十分な領域に小型化したAtgl-Atg13複合体について、Kluyveromyces marxianus(Km)のホモログを用いることで良質な結晶の作製に成功し、分解能2.5Åで構造決定することに成功した。Atg1のAtg13結合領域はMITドメインが2つ並んだ構造を取っており、N末端側からMIT1およびMIT2と命名した。Atg13のAtg1結合領域はMIT interactingmtif(MIM)が2つ並んだ構造を取っており、N末端側からMIM1、MIM2と命名した。結合領域の詳細な変異体解析を行った結果、Atg1 MIT2-Atg13 MIMl間の相互作用がAtg1-Atg13間の親和性の大部分を担っていること、この相互作用は酵母におけるオートファジーの進行に必須であることが明らかとなった。一方、Atg1 MITI-Atg13 MIM2間の相互作用はAtg1-Atg13間の親和性への寄与は小さかったが、酵母におけるオートファジーの効率的進行には必要であることが明らかとなった。Atg1との親和性を担うMIMIにはリン酸化を受けるSer/Thr残基が存在しないこと、酵母を用いた解析でAtgl3のMIM2下流のC末端領域が飢餓依存的なAtg1-Atg13間相互作用に重要であることが明らかとなったことから、結合部位の直接的なリン酸化ではなく、異なる部位のリン酸化を通してAtg1-Atg13間の相互作用が制御されていることが明らかとなった。・Atg1-Atg13-Atg17-Atg29-Atg31の5者複合体の調製と結晶化について Atg13の詳細なドメイン解析の結果、Atg17との結合に関与する領域を二ヶ所同定した。生化学的解析および酵母を用いた解析で、Atg17結合領域のリン酸化がAtg13-Atg17間の相互作用を制御していることを明らかにした。さらに同定した結合領域を用いることで、Atg13-Atg17-Atg29-Atg31四者複合体結晶の調製に成功した。現在四者複合体の構造決定を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 本年度はAtg1-Atg13複合体とAtg17-Atg29-Atg31複合体の調製と結晶化を行うことを目標としていた。上述したように、本年度は小型化したAtg1-Atg13複合体の立体構造を分解能2.5Aで決定し、両者の相互作用の詳細を明らかにした。さらにAtg13-Atg17-Atg29-Atg31複合体の結晶の調製にも成功し、初期構造を得ている。また、構造情報および出芽酵母を用いた機能解析の結果から、飢餓時にAtg13の脱リン酸化を通してAtg1キナーゼ複合体が構築される分子機構の一端を明らかにすることができ、計画以上の進展がみられた。
Strategy for Future Research Activity	Atg1のキナーゼ領域の発現は当初から予想されていた通り難航している。様々な組み合わせでの他のAtgタンパク質の共発現、ドメイン解析等を行っているが良好な発現は得られていない。そこで来年度は、大腸菌での発現から、昆虫細胞での発現へ移行することを計画している。 Atg1-Atg13-Atg17-Atg29-Atg31の5者複合体の調製については、現在4者複合体の構造決定を進めており、その構造が得られ次第、最小化した5者複合体を設計し、その調製と結晶化へ着手していきたいと考えている。