水晶発振子を用いる分子シンクロナイゼーションの定量的評価

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13022223
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 岡畑 恵雄 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (80038017)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古澤 宏幸 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (60345395) ; 川崎 剛美 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (60334504) ; 森 俊明 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (50262308)
• Keywords: DNAポリメラーゼ / 水晶発振子 / DNA固定化発振子 / 4穴式水晶発振子 / 酸素反応機構

Research Abstract

水晶発振子マイクロバランス法を用いて生体中でおこる微細な各反応を質量変化としてとらえ、シンクロナイズされた全反応を定量的に評価することを目的として以下の研究成果をあげた。
1)27MHz水晶発振子の金電極表面にビオチン-アビジン法を用いてプライマー/テンプレート部をもつDNA鎖を固定化し、水溶液中にポリメラーゼ(大腸菌由来のklenow fragment)とモノマー(dGTP or dATP)を加え、DNAのポリメラーゼ反応を振動数(重量)変化として追跡する事に成功した。
2)各素過程はシンクロナイズされて進行するので、酵素のDNA鎖への結合過程(Ka/M-1),テンプレート鎖に沿った重合過程(km.kcat)および重合したDNA鎖からの脱離過程(Kd/M-1)の動力学定数を求めることができた。
3)プライマーやテンプレート部分のDNAの塩基配列を変えたときの酵素の結合速度や重合速度、あるいは酵素の脱離速度について検討し、酵素重合速度がテンプレート鎖長に依存することがわかった。
4)酵素がテンプレート部分をすべりながら重合していく過程を詳しく検討し、ポリメラーゼが最初にテンプレートに結合し、DNA鎖上を滑りながら重合していくことが明らかにできた。

Research Products

• [Publications] S.Fukusho, H.Furusawa, Y.Okahata: "In vitro Selection and Evaluation of RNA Aptamers that recognize Arginine-rich motif Model Peptide on a Quartz-crystal Microbalance"Chem.Commun.. 88-89 (2002)
• [Publications] T.Mori, M.Li, A.Kobayashi, Y.Okahata: "Reversible Control of Enzymatic Transglycosylations in Supercritical Fluoroform using a Lipid-Coated β-D-Galactosidase"J.Am.Chem.Soc.. 124. 1188-1189 (2002)
• [Publications] Y.Hoshino, S.Tajima, H.Nakayama, Y.Okahata: "A RNA-aligned Film prepared from a RNA-Lipid Complex"Maromolecular rapid Commun.. 23. 253-255 (2002)
• [Publications] H.Furusawa, Y.Kitamura, N.Hagiwara, T.Turimoto, Y.Okahata: "Binding Kinetics of the Toroidal-shaped PCNA to DNA Strands on a 27 MHz Quartz-Crystal Microbalance"ChemPhysChem.. No.5. 446-448 (2002)
• [Publications] H.Matsuno, Y.Okahata: "Direct Monitoring of DNA Cleavages catalyzed by an ATP-dependent Deoxyribonuclease on a 27 MHz Quartz-Crystal Microbalance"Chem.Commun. 470-471 (2002)