パリトキシンをツールとして解明するATPase酵素分子内チャネルの部位と機能

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13024261
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 伊藤 勝昭 宮崎大学, 農学部, 教授 (70136795)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 明石 良 宮崎大学, 農学部, 助教授 (20253809)
• Keywords: パリトキシン / Na, K-ATPアーゼ / チャネル / Ca-ATPアーゼ / 遺伝子導入 / 酵母 / 赤血球

Research Abstract

1.Na, K-ATPaseおよびそのキメラを発現させた酵母におけるパリトキシン感受性チャネルと触媒機能との関係 パリトキシン(PTX)はNa, K-ATPaseのαサブユニット内にあるチャネルを開口した状態にする。αサブユニットは小胞体Ca-ATPaseと相同性が高いので、ATP加水分解部位をCa-ATPaseに置換したキメラ遺伝子(NCN)を作成し、本来Na, K-ATPase遺伝子を持たない酵母に発現させて、PTXによるK^+流出作用をチャネル開口の指標として観察した。さらに野生型(NNN)およびNCNが強心配糖体ウアバインに抵抗性になるよう変異させた遺伝子も導入した。PTXがNCNにおいてもチャネル開口を起こし、チャネルと触媒部位が独立していることは前回報告した。ウアバインはNNN、NCNでPTXの作用に拮抗した。細胞内ATPを減少させる、あるいは酵素へのATP結合を妨害するとPTXの作用は低下した。このことからATPが酵素に結合してコンフォメーション変化が起こるとチャネル開口が促進されることが示唆された。ウアバイン抵抗性NNNあるいはNCNでもPTXは作用を示したが、ウアバインは高濃度を用いてもPTXの作用に拮抗しなかった。このことは、PTX結合部位は高親和性ウアバイン結合部位と一部共有するが完全にはオーバーラップしないことを示唆する。
2.ツメガエル卵母細胞でのPTXの作用 ツメガエル卵母細胞にウアバイン抵抗性NNNおよびNCNを導入して電圧固定法でPTXチャネル電流を観察するため注入用cRNAを作成した。今年度はその遺伝子を発現した細胞でのデータを得るまでには至らなかったが、卵母細胞に内在するNa, K-ATPaseに作用するかを観察したところ、PTXは持続性内向き電流を発生させ、これはウアバインで抑制された。この結果をもとに、ウアバインで内在性酵素を阻害した条件で発現させたキメラ酵素のチャネルコンダクタンスを測定するところに来ている。
3.チャネル開口の細胞内pHによる調節 赤血球でcyclic GMPを増加させてPKGを活性化するとPTXの作用が増強された。これには細胞内pHの上昇が関係し、細胞内アルカリ化でPTXおよびウアバインの結合が増加することが示された。この機序を検討中である。
以上よりATPase内チャネルの閉塞、開口にはATPやH^+イオンが重要であることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Ito K, Toyoda I, Higashiyama M, Uemura D, Sato M, Yoshimura SH, Ishii T, Takeyasu K.: "Induction of channel by palytoxin in yeast cells transfected with a chimeric ATPase between Na^+, K^+-ATPase and Ca^<2+>-ATPase"FEBS Lett.. (印刷中).