ゲンジボタル・ルシフェラーゼ反応中間体アナログ複合体のX線結晶構造解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13024275
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 加藤 博章 理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, チームリーダー(研究職) (90204487)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中津 亨 理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, 連携研究員 (50293949)
• Keywords: 生物発光 / オキシルシフェリン / ルシフェラーゼ / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / ATP / ホタル / 酵素反応

Research Abstract

本計画の目標は、ルシフェラーゼと反応中間体アナログ、アデニル化デヒドロルシフェリンとの複合体のX線結晶構造解析を行い、アデニル化ルシフェリンの結合様式の構造的な基盤を明らかにすることにある。そして、その結果に基づいて、さらに次の反応段階を捉えるための鍵となる新たな中間体アナログのデザインを行おうとするものである。昨年度の報告後さらにルシフェラーゼ:デヒドロルシフェリン:ATP複合体の結晶化条件の検討を行ったところ、1.5Å分解能までデータが向上した。このデータを用いて、構造モデルの精密化を行ったところ、デヒドロルシフェリンに相当する良好な電子密度が得られた。しかしこの電子密度から考えられたデヒドロルシフェリンの結合様式は、チアゾール環についているカルボキシル基がATPのαリン酸の方を向いておらず、本来予想していた結合様式とは反対のものであった。またデヒドロルシフェリンを用いた阻害実験から、その阻害様式は拮抗阻害であり、デヒドロルシフェリンは酵素中でATPとは反応しないような向き活性部位に入ることで阻害すると考えられた。
そこで、より詳細なルシフェリン結合に関する情報を得るために、発光反応終了後、すなわちルシフェラーゼ:AMP:オキシルシフェリン複合体の結晶化及びX線結晶構造解析を行った。その結果1.6Å分解能のX線回折強度データが得られ、このデータをもとに分子置換法により構造を決定した。AMPおよびオキシルシフェリンに相当する電子密度が得られたものの、オキシルシフェリンに相当する電子密度はやはりAMPの電子密度に比べてぼやけていた。現在、オキシルシフェリンの硫黄原子に相当する強い電子密度の位置をもとに構造の精密化を行っている。