ゲンジボタル・ルシフェラーゼ反応中間体アナログ複合体のX線結晶構造解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13024275
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 加藤 博章 京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中津 亨 理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, 連携研究員 (50293949)
• Keywords: ルシフェラーゼ / ルシフェリン / ホタル / 生物発光 / SPring-8 / X線結晶構造解析 / 反応中間体アナログ / 酵素阻害剤

Research Abstract

本計画の目標は、ルシフェラーゼと反応中間体アナログであるデヒドロルシフェリルアデニレートとの複合体および、嫌気条件下におけるルシフェラーゼと真のアデニレート中間体との複合体のX線結晶構造解析を行い、アデニル化ルシフェリンの結合様式の構造的な基盤を明らかにすることにある。
そこでリン酸基をスルファモイル基、ルシフェリン部分をデヒドロルシフェリンに変更した5'-O-[N-(dehydroluciferyl)-sulfamoyl adenosine (DLSA)を合成し、共結晶化を行った。その結果、1.3Å分解能の回折強度データが得られた。得られた回折強度データを用いて構造解析を行った結果、DLSAを示す良好な電子密度図が得られた。活性部位近傍についてルシフェラーゼ:生成物複合体の立体構造と比較したところ、α-リン酸の部分は約0.7Å移動していた。この移動に連動してルシフェラーゼのHis247がわずかに移動していることが観測された。しかしその他のアデニン、リボースおよびルシフェリンの部分においてはそれほど位置のずれは観測されなかった。
一方、ルシフェリルAMP中間体に酸素が攻撃する状態の構造を捉えるため、嫌気条件下でLH2、ATPとともに本酵素を結晶化することを計画した。99.98%アルゴンガス存在下でこのサンプルを用いて結晶化を行ったところ、黄緑色の結晶が得られた。現在、この結晶のX線結晶解析を検討中である。

Research Products

• [Publications] Tetsuya Shimizu: "Active-Site Architecture of Endopolygalacturonase I from the Pathogenic Fungus, Stereum purpureum, Revealed by Crystal Structures in Native and Ligan-Bound Forms at Atomic Resolution"Biochemistry. 41. 6651-6659 (2002)
• [Publications] Emiko Yamauchi: "Crystal structure of MARCKS calmodulin-binding domain peptide complexed with Ca2+ Calmodulin"Nature. Struct. Biol.. 10. 226-231 (2003)