プロテインチップによる内分泌撹乱物質のリスクアセスメント法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13027269
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 村田 正治 九州大学, 工学研究院, 助手 (30304744)
• Keywords: 内分泌撹乱物質 / バイオセンサ / 核内レセプター / 電気科学計測 / プロテインチップ

Research Abstract

バクテリア発現系によって、ヒトエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン(hER-LBD)をヒスチジンタグとの融合タンパク質として大量発現させた。これを新たに合成した末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hER-LBD三元複合体を金ディスク電極表面上へ固定化した。
リガンドとの結合実験はサイクリックボルタンメトリーによって行った。hER-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに所定の濃度の17β-エストラジオールを加えて電気化学的応答を観察したところ、添加したエストラジオールの濃度に応じてピーク電流値が大きく減少した。この現象はhER-LBDを固定化していない電極では全く観察されなかったことから、ピーク電流値の減少は電極表面上におけるレセプター-リガンド間の特異的な相互作用によるものと示唆された。女性ホルモンの添加濃度とピーク電流の減少量との関係をプロットした結果、得られた検量線は10^<-10>Mから10^<-7>Mまで線形応答が得られており、その検出感度はRI標識リガンドを用いた競合アッセイ法に匹敵した。ERはリガンドとの結合によって、その立体構造を変化させホモ二量体を形成することが知られている。本検出系では、このコンホメーション変化にともなって大きく変化したタンパク質の表面物性を、マーカーイオンの透過性に基づく電気化学的応答によって捉えたものと考えられる。このセンサは17β-エストラジオールに対して優れた応答特性を示した。本バイオセンサの測定時間は約1分と極めて高速であり、その検出感度も従来法に匹敵したことから、内分泌撹乱物質に対する新しいセンシングシステムとして有効である。

Research Products

• [Publications] M.Murata: "Bioaffinity Sensor for Endocrine Disruptor using Receptor-modified Au Electrode"Analytical Sciences. (印刷中).
• [Publications] T.Shibata: "Sequence-Specific Detection of Double-Strand DNA Using An Electrode Modified with DNA Binding Protein"Analytical Sciences. (印刷中).
• [Publications] K.Tsukagoshi: "Migration Behavior of the Polymer Particles Possessing Carboxylate and Borate Moieties in Capillary Electrophoresis"Chemistry Letters. 2001. 926-927 (2001)
• [Publications] M.Murata: "Novel Biosensor for the Rapid Measurement of Estrogen Based on a Ligand-receptor Interaction"Analytical Sciences. 17. 387-390 (2001)