2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13031023
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小畠 英理 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (00225484)
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| Keywords | 疎水性相互作用 / タンパク質 / バイオテクノロジー / 特殊環境耐性 |
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| Research Abstract |
本年度は、疎水性基板に対して自己集積化する分子認識タンパク質を構築した。疎水性ユニットと、抗体分子認識ユニットを交互に組み合わせたタンパク質EBn(n=1,2,4)を設計し、これをコードするプラスミドpET-EBnを構築して、大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。これらのタンパク質は、誘導発現した菌体破砕液の可溶画分よりアフィニティー精製し、設計したタンパク質EBnを得た。EBnを疎水的であるHOPG表面と親水的であるmica表面にそれぞれ集積し、その集積状態を原子間力顕微鏡を用いて観察した。その結果、EBnは疎水性表面では効率良く集積されるのに対し、親水性表面ではほとんど集積されなかった。とくにEB4は、HOPG表面の90%近くを覆い、凝集することなく平面的に集積されることが明らかとなった。EBnの抗体結合能は、固相上に固定した抗体に対してプロテインAとの競合反応を行うことにより評価した。その結果、EBはプロテインAよりも抗体結合能が低いものの、EB2では同程度、EB4ではプロテインAよりも高い抗体結合能を示した。この抗体結合能は、固相集積後も保持されていた。以上の結果から、EB4が最も抗体結合能に優れ、かつ基板に集積後も高い抗体結合能を保持していることが示された。そこでEB4を100nMの濃度でコートしたプレートにおける抗体集積活性を、酵素免疫測定法により評価した。その結果、EB4をコートしたプレートでは、何もコートしていないプレートと比較して、抗体の集積効率の向上がみられた。特に抗体を1μg/ml添加したときには、EB4をコートしたプレートの方が、約二倍量の抗体を基板に集積することができた。
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[Publications] T.Ebihara, H.Takayama, Y.Yanagida, E.Kobatake, M.Aizawa: "Thermostabilization of protein A-luciterase fusion protein by single amino acid mutation"Biotechnol.Lett.. 24. 147-149 (2002)
