7本膜貫通型レチナール異性化酵素・レチノクロムの結晶化とロドプシンとの構造比較

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13033022
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 寺北 明久 京都大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (30212062)
• Keywords: ロドプシン / レチノクロム / 光異性化酵素 / レチナール / 立体構造 / 生物マシナリー / GPCR / 結晶化

Research Abstract

ロドプシンは"inverse agonist"として11シス型レチナールを結合しており、光受容によりレチナールが"agonist"である全トランス型に異性化され、蛋白質が構造変化し、G蛋白質を活性化する。一方、レチノクロムは、ロドプシンとは逆に全トランス型レチナールをリガンドとし、11シス型に光異性化する(ロドプシンに発色団を供給するレチナール異性化酵素)。本研究では、同じ7本膜貫通型構造を有する両蛋白質が、どのような三次元構造的な制御を受けて、異なる「生物マシナリー」を実現しているのかを構造学的に明らかにするために、精製したレチノクロムを用いて、高濃度勾配蒸気拡散法により「ヘリックス配置の同定が可能な結晶」の作製をめざした。また、培養細胞から得たロドプシンの結晶化にも取り組んだ。
培養細胞系の確立:レチノクロムを恒常的に2mg/L発現する細胞系を、HEK293Sを用いて、作製することに成功した。また、ロドプシンについてもほぼ同様の細胞系を確立した。これらの発現系をベースとし、単クローン抗体架橋アガロースを用いたカラムクロマトグラフィーにより、4.5mg/月以上の高度精製レチノクロムを得ることに成功した。
レチノクロムについては、高濃度勾配蒸気拡散法により再現性よく結晶化する条件を見い出すことに成功した。現在、大きく成長した結晶について、ヘリックス配置の同定をめざし、X線回折を行いつつある。
ロドプシンについては、野生型では高品質の結晶を再現性よく得ることに成功している。また、変異体についても野生型同様に結晶化できる条件を見いだした。

Research Products

• [Publications] T.Nagata: "Isomer-specific interaction of the retinal chromophore with threonine-118 in rhodopsin"J. Phys. Chem.. 106. 1969-1975 (2002)
• [Publications] M.Koyanagi: "Amphioxus homologs of Go-coupled rhodopsin and peropsin having 11-cis-and all-trans-retinals as thier chromophores"FEBS Lett.. 531. 525-528 (2002)
• [Publications] Kuwayama: "Conserved proline residue at position 189 in cone visual pigments as a determinant of molecular properties different from rhodopsins"Biochemistry. 41. 15245-15252 (2002)
• [Publications] Y.Nakashima: "Origin of the vertebrate visual cycle : retinal photoisomerase and two putative visual cycle proteins are expressed in whole brain of a primitive chordate"J. Comp. Neurol.. (印刷中). (2003)
• [Publications] A.Terakita: "Insight into rhodopsin diversity from viewpoint of couterion"J. Photosci.. 9. 33-36 (2002)
• [Publications] 岡田哲二: "ロドプシンの結晶構造からみるG蛋白質共役受容体の構造・機能関連"蛋白質核酸酵素. 147. 1123-1130 (2002)