DNA複製・細胞周期チェックポイントを制御する複合体の統合的立体構造解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13033028
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (30156195)
• Keywords: DNA複製 / ヒトMcm蛋白質 / ドーナツ型構造 / Pull down assay / Two-hybrid assay / ヘテロ4量体 / ヘテロ6量体 / 電子顕微鏡

Research Abstract

6種類のヒトMcm蛋白質(HsMcm2,-3,-4,-5,-6,-7)のうち、DNAヘリカーゼ活性を有するMcm4-6-7複合体はおよそ600kDaの、活性を有さないMcm2-4-6-7複合体はおよそ440kDaの安定な複合体を形成する。1つのMcm蛋白質の分子量(約100kDa)を考慮するとMcm4-6-7はヘテロ6量体、Mcm2-4-6-7はヘテロ4量体を形成していると推測される。最近我々は、電子顕微鏡観察によりMcm4-6-7複合体がその中心にチャネルを有するドーナツ型の構造をとることを見出した。そこで、Mcm4-6-7複合体中のそれぞれのMcmがどのMcmと高い親和性を有しているかを調べるために、大腸菌で発現させ精製したGST-Mcm4,-Mcm6,-Mcm7用いてPull down assayを行った。具体的には、各Mcmの1対1の結合をみるために、大腸菌にFLAG-Mcm6,-Mcm7をそれぞれ発現させた菌体破壊液に各GST-Mcm蛋白質を混ぜた後、グルタチオンセファロースによりGST-Mcmを沈降させてその沈降物中にあるFLAG-Mcm蛋白質をウエスタンブロットで検討した。その結果、Mcm4とMcm6、Mcm4とMcm7およびMcm6とMcm6の高い相互作用が認められた。また、Two-hybrid assayにおいてもMcm6とMcm6の相互作用が確認された。これは、Mcm6がホモ2量体を形成することを示唆する。Mcm6とMcm7、Mcm7とMcm7については弱い相互作用が確認された。これらのことから、Mcm4-6-7複合体は、Mcm7-Mcm4-Mcm6-Mcm6-Mcm4-Mcm7の順序でヘテロ6量体を形成すると考えられる。さらに、同様にしてMcm2についても検討した結果、Mcm2は、Mcm4,Mcm6,Mcm7のいずれのMcmとも相互作用することがわかった。

Research Products

• [Publications] Watanabe, T., Miyashita, K., Saito, T.T., Yoneki, T., Kakihara, Y., Nabeshima, K., Kishi, Y.A., Shimoda, C., Nojima, H.: "Comprehensive isolation of meiosis specific genes identifies many unusual non-coding transcripts in Schizosaccharomyces pombe"Nucleic Acids Research. 29・11. 2327-2337 (2001)
• [Publications] Nabeshima, K., Kakihara, Y., Hiraoka, Y., Nojima, H.: "A novel meiosis-specific protein of fission yeast Meu13p, promotes homologous pairing independently of homologous recombination"EMBO Journal. 20・14. 3871-3881 (2001)
• [Publications] Molnar, M., Parisi, S., Kakihara, Y., Nojima, H., Yamamoto, A., Hiraoka, Y., Bozsik, A., Sipiczki, M., Kohli, J.: "Characterization of rec7, an early meiotic recombination gene in Schizosaccharomyces pombe"Genetics. 177・2. 519-532 (2001)