DNA複製・細胞周期チェックポイントを制御する複合体の統合的立体構造解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13033028
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (30156195)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥崎 大介 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (00346131) ; 薮田 紀一 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (10343245)
• Keywords: Mcm蛋白質 / DNA複製 / 電子顕微鏡 / 画像を解析 / ドーナツ型構造 / プルダウンアッセイ / ツーハイブリッドアッセイ / DNAヘリカーゼ活性

Research Abstract

我々は電子顕微鏡観察により、6種類のヒトMcm蛋白質(HsMcm2,-3,-4,-5,-6,-7)のうちDNAヘリカーゼ活性を有するMcm4-6-7複合体(ヘテロ6量体)およびその活性が阻害されたMcm2-4-6-7複合体(ヘテロ4量体)の構造を解析した。その結果、まずヒトMcm4-6-7複合体は外径が13-14nm、内径が3-4nmのドーナツ型の構造をとることを見出した。次に、ヒトMcm2-4-6-7複合体については1462個の画像を解析した結果、509,441,278,234という4種類のグループに分かれた。そのうち509,441個の画像はよく似た4つの角を持つ外径が15-18nm、内径が3-4nmのドーナツ型の構造をとっていた。これら4つの角は各HsMcm2,-4,-6,-7蛋白質に由来する画像では無いかと予測される。とくに509個の画像は角のひとつから腕のようなものが伸びているため、この画像がサイズの最大なHsMcm2に由来するのではないかと予想した。この他、大腸菌で発現させ精製したGST-Mcm4,-Mcm6,-Mcm7用いてプルダウンアッセイを行いMcm4とMcm6、Mcm4とMcm7およびMcm6とMcm6の高い相互作用を見出した。また、ツーハイブリッドアッセイも行い、Mcm2とMcm6およびMcm6とMcm6の相互作用を確認した。これは、Mcm6がホモ2量体を形成することを示唆する。これらの結果を総合して、Mcm2-4-6-7ヘテロ4量体ではMcm2,Mcm6,Mcm4,Mcm7の順番で、Mcm4-6-7はヘテロ6量体ではMcm7-Mcm4-Mcm6-Mcm6-Mcm4-Mcm7の順序でドーナツ型の構造をとっていると結論した。

Research Products

• [Publications] Shimada, M., Nabeshima, K., Tougan, T., Nojima, H.: "The meiotic recombination checkpoint is regulated by checkpoint rad+ genes in fission yeast"EMBO Journal. 21・11. 2807-2818 (2002)
• [Publications] Watanabe, T., Miyashita, K., Saito, T.T., Nabeshima, K., Nojima, H.: "Abundant poly (A)-bearing RNAs that lack open reading frames in schizosaccharomyces pombe"DNA Research. 9・1. 1-7 (2002)
• [Publications] Fujii, T., Tamura, K., Masai, K., Tanaka, H., Nishimune, Y., Nojima, H.: "Use of stepwise subtraction to comprehensively isolate mouse genes whose transcription is upregulated during spermiogenesis"EMBO Report. 3・4. 367-372 (2002)
• [Publications] Kimura, S.H., Nojima, H.: "Cyclin G1 mediates the association of MDM2 with ARF and promotes p53 accumulation"Genes Cells. 7・8. 869-880 (2002)