補酵素結合型タンパク質の精密X線解析と生体触媒設計

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13125207
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 広津 建 大阪市立大学, 大学院・理学研究科, 教授 (10047269)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴田 直樹 姫路工業大学, 大学院・理学研究科, 助手 (30295753) ; 森本 幸生 姫路工業大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (80200450) ; 宮原 郁子 大阪市立大学, 大学院・理学研究科, 講師 (40271176)
• Keywords: アルギニノコハク酸合成酵素 / グルタミンアミドトランスフェラーゼ / 高度好熱菌 / 基質認識 / 分子内チャネル / X線結晶解析 / PLP酵素 / フラビン依存型酵素

Research Abstract

アルギニノコハク酸合成酵素(AsS)は、ATPを利用して、シトルリンとアスパラギン酸からアルギニノコハク酸を生成する反応を触媒する。高度好熱菌由来のAsS(tAsS)のネイティブ型、ATP(ATPアナログ)および基質(アナログ)などとの複合体のX線構造解析を行い、これらの立体構造を約2.2Å分解能で決定した。tAsSはD2対称を持つ4量体酵素で、サブユニットは大、小のドメインとC末端のアームからなる。複合体の構造はネイティブの構造と極めてよく似ていた。この事から、ATPと基質の結合に際して、大腸菌由来AsSに見られるようなコンフォメーション変化を、tAsSは起こさないことがわかった。ATPと基質は活性部位に互いに反応部位が隣接して結合し、反応が進むのに都合の良い幾何学的配置をとるので、tAsSは、反応を進めるのに、立体構造を大きく変化させる必要がないのである。
イミダゾールグリセロールリン酸合成酵素(IGPS)は、イミダゾール環の形成反応を触媒している。IGPSは活性アンモニアを精製するhisHサブユニットと、サイクラーゼ活性を持つhisFサブユニットからなる。hisHで生成したアンモニアが、hisFの活性部位へと酵素内部を移動する。このアンモニア移動のメカニズムと活性調節を理解するために、高度好熱菌由来のIGPSのX線結晶構造解析を行い、その立体構造を2.3Å分解能で決定した。(α/β)8バレル構造をもつhisFとグルタミナーゼ構造をもつhisHの活性部位間は約20Åのトンネルで結ばれている。hisH/hisF境界面に存在する4つの極性残基のうちLys100が水素結合をスイッチすることによって、アンモニアが塩橋部分を通過するメカニズムを検討した。
これらに加えて数種のPLP酵素およびフラビン酵素の構造と機能の研究を行った。

Research Products

• [Publications] C.Setoyama, Y.Nishina, H.Tamaoki, H.Mizutani, I.Miyahara, K.Hirotsu, K.Shiga, R.Miura: "Effects of hydrogen bonds in association with flavin and substrate in flavoenzyme D-amino acid oxidase. The catalytic and structural roles of Gly313 and Thr317"Journal of Biochemistry. 131(1). 59-69 (2002)
• [Publications] Y.Nakajima, I.Miyahara, K.Hirotsu, Y.Nishina, K.Shiga, C.Setoyama, H.Tamaoki, R.Miura: "Three-dimensional Structure of the Flavoenzyme Acyl-CoA Oxidase-II from Rat Liver, the Peroxisomal Counterpart of Mitochondrial Acyl-CoA Dehydrogenase"Journal of Biochemistry. 131(3). 365-374 (2002)
• [Publications] M.Goto, Y.Nakajima, K.Hirotsu: "Crystal structure of argininosuccinate synthetase from Thermus thermophilus HB8. Structural basis for the catalytic action"Journal of Biological Chemistry. 277(18). 15890-15896 (2002)
• [Publications] R.Omi, H.Mizuguchi, M.Goto, I.Miyahara, H.Hayashi, H.Kagamiyama, K.Hirotsu: "Structure of Imidazole Glycerol Phosphate Synthase from Thermus thermophilus HB8 : Open-Closed Conformational Change and Ammonia Tunneling"Journal of Biochemistry. 132(5). 759-765 (2002)
• [Publications] M.Goto, Y.Agari, R.Omi, I.Miyahara, K.Hirotsu: "Expression, purification and preliminary X-ray characterization of N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase from Thermus thermophilus HB8"Acta Crystallogr. D BioL Crystallogr. 59(2). 356-358 (2003)
• [Publications] M.Goto, R.Omi, J.Hoseki, N.Nakagawa, I.Miyahara, K.Hirotsu: "Expression, purification and preliminary X-ray characterization of CTP synthetase from Thermus thermophilus HB8"Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59(3). 551-553 (2003)
• [Publications] Y.Nakajima, I.Miyahara, K.Hirotsu, et al.: "Structural Comparison of Acyl-CoA Oxidase-II from Rat liver (Eds. S. Chapman, R. Perham, N. Scrutton, Flavins and Flavoproteins)"Agency for Scientific Publ. Berlin. 6 (2002)