酵素法による非天然型の機能性DNAの合成とその応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13132202
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 沢井 宏明 群馬大学, 工学部, 教授 (70012648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾崎 広明 群馬大学, 工学部, 助教授 (90211820)
• Keywords: 核酸 / PCR / 酵素反応 / 生体機能利用 / DNAアプタマー / DNA触媒 / 試験管内選択 / 機能性DNA

Research Abstract

DNAの本来の機能と全く異なる、触媒活性などを持つ機能拡張DNAの創製とその応用は今後の大きな研究課題である。高活性で高機能性DNAの創製のためには、天然型のDNAでは不充分で、機能性基を導入した非天然型の修飾DNAの酵素合成、増幅が望まれる。そこで、5位に機能性を導入した種々のチミヂン誘導体を合成し、それらを基質に用いる酵素法による修飾DNAの合成について検討した。酵素、DNAポリメラーゼは基質特異性、鋳型特異性が厳密で、天然型のDNAの様に合成出来るとは限らない。古細菌由来のある種の耐熱性DNAポリメラーゼ(KOD Dash)のみが5位に置換基を有するチミヂン誘導体を基質として取り込み、対応する修飾DNAの酵素合成が可能であることを見出した。さらに、この酵素がチミヂン誘導体に対してどのような機能性基を導入した場合、基質として取り込むかどうかを検討した結果、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンを導入したアミノ基の+電荷を持つ誘導体、中性のメチルエステル導入体、-電荷を持つカルボン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミンの末端アミノ基を介して更にビオチンあるいはトリフロロ酢酸を導入した誘導体は基質として受け入れられ、対応する修飾DNAの合成が可能であった。一方、短いリンカーを介してバルキーな置換基を導入した誘導体は酵素による取り込みが阻害され、対応する修飾DNAは得られなかった。さらに、得られた知見をもとに、種々の機能性基を導入した修飾DNAのPCR法(DNAの重合連鎖反応)による大量合成法を確立した。現在、このPCR法による機能性DNAの合成を応用して修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の探索、創製の研究を展開している。

Research Products

• [Publications] H Sawai, A.N.Ozaki, F.Satoh, T.Ohbayashi, M.M.Masud, H.Ozaki: "Expansion of structural and functional diversities of DNA using new 5-substituted deoxyuridine derivatives by PCR with superthermophilic KOD Dash DNA polymerase"Chem. Commun. 2604-2605 (2001)
• [Publications] H.Ozaki, S.Momiyama, K.Yokotsuka, H.Sawai: "Post-synthetic functionalization of oligodeoxyribonucleotides at the 2'-position"Tetrahedron lett.. 42. 677-680 (2001)
• [Publications] H.Ozaki, M.Mine, Y.Ogawa, H.Sawai: "Effect of the terminal amino group of a linker arm and its length at the C5 position of pyrimidine nucleosides on the thermal stability of a DNA duplex"Bioorganic Chemistry. 20. 117-130 (2001)
• [Publications] M.M.Masud, A.N.Ozaki, F.Satou, T.Ohbayashi, H.Ozaki, H.Sawai: "Enzymatic synthesis of modified DNA by PCR"Nucleic Acids Res., Suppl 1. 21-22 (2001)
• [Publications] K.Shinozuka, Y.Nakashima, K.Shimizu, H.Sawai: "Synthesis and characterization of polyamine-based biomimetic catalysis as a artifical ribonuclease"Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 29. 187-197 (2001)