酵素法による非天然型の機能性DNAの合成とその応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13132202
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 澤井 宏明 群馬大学, 工学部, 教授 (70012648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑原 正靖 群馬大学, 工学部, 助手 (40334130) ; 尾崎 広明 群馬大学, 工学部, 助教授 (90211820) ; 篠塚 和夫 群馬大学, 工学部, 教授 (20206105)
• Keywords: 核酸 / DNA / 酵素反応 / 生体機能利用 / DNAポリメラーゼ / 分子認識 / アプタマー / 糖鎖

Research Abstract

機能性基を導入した修飾DNAのPCR法による酵素的な合成が可能となれば、新しい機能性修飾DNAの創製、in vitro Selectionによる修飾DNAアプタマー、修飾DNA触媒の創製への応用が可能になると考えられる。昨年度までの研究成果をふまえ、リジン、アルギニン、ヒスチヂンなど15種のアミノ酸などの機能性基をC5位に導入したチミヂン誘導体を合成した。これらを基質に用い、KOD Dash DNAポリメラーゼを用いたPCR法(DNAの重合連鎖反応)による機能性修飾DNAの合成の可能性の検討、大量合成法の確立をはかった。さらに、チミジン誘導体以外に5位に置換基を有する2'-デオキシシチヂン誘導体あるいは2-アミノアデニン-誘導体などの三りん酸体を基質として受け入れる事が出来る好熱性DNAポリメラーゼの探索を進めた。その結果、K0D Dash, Vent(exo-)など数種のDNAポリメラーゼを用いた時に、対応する修飾DNAが合成できることを見出した。また、上記修飾チミジン誘導体及び修飾シチヂン誘導体の2種を同時に取り込んだダブル修飾DNAのPCR法による合成が可能であることを明らかにした。さらにPCR法による修飾DNAの合成反応及び試験管内選択法を適用し、最近薬剤として注目されているサリドマイド、細胞表面に存在しインフルエンザなどのウイルス感染に直接関係する糖鎖シアリルラクトースなどの特定の分子に結合する新規修飾DNAアプタマーの創製を行った。それらの配列解析、2次構造の予測、結合に関連する部位の解析、結合の強度などの測定などを行い、修飾DNAを基盤とするアプタマーの創製法を確立した。

Research Products

• [Publications] M.M.Masud, A.Ozaki-Nakamura, M.Kuwahara, H.Ozaki, H.Sawai: "Modified DNA Bearing 5-(Methoxycarbonylmethy;)-2'-deoxyuridine: Preparation by PCR with Thermophilic DNA Polymerase and Postsypthetic Derivatization"ChemBioChem. 4. 584-588 (2003)
• [Publications] H.Sawai, A.Hirano, H.Mori, K.Shinozuka, B.Dong, R.H.Silverman: "Synthesis, Characterization and Biological Properties of 8-Azid and 8-Amino Substituted 2'-5' Oligoadenylates"J.Med.Chem.. 46. 4926-4932 (2003)
• [Publications] M.Kuwahara, Y.Takahata, A.Shoji, A.N.Ozaki, H.Ozaki, H.Sawai: "Substrate Properties of C5-Substituted Pyrimidine 2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate for thermstable DNA Poltmerases during PCR"Bioorg, Med.Chem.Lett.. 13. 3735-3738 (2003)
• [Publications] H.Ozaki, K.Nakajima, K.Tatsui, C.Izumi, M.Kuwahara, H.Sawai: "Convenient Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides Bearing Arabinofuranosyl Pyrimidine Derivatives and Its Duplex Formation with Complementary DNA"Bioorg, Med.Chem.Lett.. 13. 2441-2443 (2003)
• [Publications] M.Kuwahara, S.Hososhima, Y.Takahata, R.Kitagawa, A.Shoji, K.Hanawa, H.Ozaki, H.Sawai: "Simultaneous Incorporation of three different modified nucleotides during PCR"Nucleic Acids, Res.Suppl.. 3. 37-38 (2003)
• [Publications] H.Ozaki, K.Nakajima, K.Yajima, K.Tatsui, M.Kuwahara, H.Sawai: "Synthesis and properties of oligonucleotides containing C-2 and/orC-5 substituted arabinofuranosyluracils"Nucleic Acids, Res.Suppl.. 3. 59-60 (2003)
• [Publications] 澤井宏明, 桑原正靖: "ゲノムケミストリー"講談社サイエンティフィック. 51-57 (2003)