動物体細胞株を使った逆遺伝学によるDNA組み換え、修復、複製の系統的解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13141202
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 園田 英一朗 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50281093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 榎本 武美 東北大学, 薬学研究科, 教授 (80107383)
• Keywords: 相同組換え / 複製後修復 / DT40 / DNA修復 / Rev3 / Rad18 / DNAポリメラーゼ / 2重鎖切断

Research Abstract

本年度は、複製後修復に関与すると考えられるポリメラーゼRev3の欠損株を作製した。すでに発表されているヒトRev3のDNA・アミノ酸配列をもとにPCR用のブライマーを設計し、ニワトリのcDNAを鋳型として、ニワトリRev3の遺伝子の一部を単離した。単離したcDNA情報をもとにゲノムDNAを単離し、ノックアウトベクターを作製した。ニワトリDT40の野性株にノックアウトコンストラクトを導入し、Rev3欠損株を作製した。Rev3欠損株は、電離放射線・紫外線・DNA架橋剤に対して感受性を示し、Rev3の上流で機能していると考えられるRad18欠損株と同様な感受性を示した。細胞周期ごとの紫外線・電離放射線感受性もRad18欠損株と同様にS期に最も強い感受性を示した。しかしながら、Rev3欠損株は電離放射線にたいしてRad18よりも強い感受性を示し、電離放射線によるDNA損傷修復に対してRad18とは異なる機構で機能していることが示唆された。細胞の相同組換え能を表す指標について調べたところ、免役グロブリン遺伝子座における遺伝子変換の頻度はほぼ野性株と同じで、遺伝子ターゲッテイングの頻度がわずかに低下していた。現在、Rev3欠損株の放射線感受性がどのような修復機構の欠損によるものかを明らかにするために、非相同末端結合能のアッセセイ、組換え後修復能のアッセイをおこなっている。また、現在まで多数の複製後修復に関与するポリメラーゼーが単離されており、お互いに相補して働いている可能性があるので、他のポリメラーゼとの2重欠損株を作製しその機能を検証している。

Research Products

• [Publications] Sonoda, E., Matsusaka, T., Morrison, C., Vagnarelli, P., Hoshi, O., Ushiki, T., Nijima, K., Fukagawa, T., et al.: "Scc1/Rad21/Mcd1 is required for sister chromatid cohesion and kinetochore function in vertebrate cells"Developmental Cell. 1. 759-770 (2001)
• [Publications] Sonoda, E., Takata, M., Yamashita, Y.M., Morrison, C., Takeda, S: "Homologous DNA recombination in vertebrate cells"Proc Natl Acad Sci USA. 98. 8388-8394 (2001)
• [Publications] Sonoda, E., Morrison, C., Yamashita, Y.M., Takata, M., Takeda, S.: "Reverse genetic studies of homologous DNA recombination using the chicken B-lymphocyte line, DT40"Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356. 111-117 (2001)
• [Publications] Takata, M., Sasaki, M.S., Tachiiri, S., Fukushima, T., Sonoda, E., Schild, D., Thompson, I.H., Takeda, S.: "Chromosome instability and defective recombinational repair ih knockout mutants of the five Rad51 paralogs"Mol Cell Biol. 21. 2858-2866 (2001)
• [Publications] Fujimori, A., Tachiiri, S., Sonoda, E., Thompson, L.H., Dhar, P.K., Hiraoka, M., Takeda, S., Zhang, Y., et al.: "Rad52 partially substitutes for the Rad51 paralog XRCC3 in maintaining chromosomal integrity in vertebrate cells"Embo J. 20. 5513-5520 (2001)