複製フォーク阻害によって誘導される組み換え反応と遺伝子増幅

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13141205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 堀内 嵩 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 教授 (60108644)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 篠原 彰 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (00252578) ; 小林 武彦 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (40270475) ; 日高 真純 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (80238310)
• Keywords: 複製フォーク / 組み換えのホットスポット / 相同的組み換え / 大腸菌 / 遺伝子増幅

Research Abstract

大腸菌の複製阻害点付近における、姉妹染色体間での組み換えの活性化の発見を端緒に、フォーク阻害と相同的組み換えの関係を解析してきた。そのきっかけになったのが、複製フォーク阻害に依存した組み換えのホットスポット(Hot)の分離同定である。一方、この同じアイデアで進めた出芽酵母の系の解析から、フォーク阻害が多数繰り返して存在するリボゾームRNA遺伝子のコピー数の増減に必須であることが強く示唆された。つまり、フォーク阻害がDNA配列の増幅の引き金になることが予想された。
このことから大腸菌のフォーク阻害に依存した組み換えのホットスポット(Hot)においても、増幅している可能性が出てきた。ここではその可能性を、フォーク阻害依存Hotの一つHotAについて詳しく調べた。その結果、RNaseH欠損株において、HotA DNAが約40倍増幅していること、その他のHotも程度の違いはあるものの全て増幅しており、特にその中のHotDとGがHotAと同レベルに増幅していたこと、パルスフィールド電気泳動法を用いた増幅したゲノムDNAの解析から、2種類の増幅様式の存在が示唆された。そこで、個々の細菌での増幅をFISH法を用いて調べた。その結果、全体の90%の菌は染色体上でマイルドな増幅(約6倍)をしているが、残り10%の細胞では平均数百倍に増幅していることが判明した。ある菌では大腸菌のゲノムサイズレベルにまで達したものもあるに違いない。
これまでの結果は全てRNaseH欠損株を用いたものである。野生株でHot活性がみられる系を用いて、増幅のRNaseH欠損依存性を調べた。その結果、この系においても増幅が起こることから、増幅現象はフォーク阻害にのみ依存すると結論した。

Research Products

• [Publications] Kobayashi, T., Nomura, M., Horiuchi, T.: "Identification of DNA cis-elements essential for expansion of ribosomal DNA repeats in Saccharomyces cerevisiae"Mol. Cell. Biol.. 21. 136-147 (2001)
• [Publications] Wai, H., Johzuka, K, Vu, L., Eliason, K., Kobayashi, T., Horiuchi, T., Nomura, M.: "Yeast RNA polymerase I enhancer is dispensable for growth and its apparent transcription enhancement for ectopic promoters Fob1 protein implicated in replication and recombination of rDNA"Mol. Cell. Biol. 21. 5541-5553 (2001)
• [Publications] Urawa, H., Hidaka, M., Ishiguro, S., Okada, K., Horiuchi T.: "Enhanced homologous recombination caused by the non-transcribed spacer of the rDNA in Arabidopsis"Mol. Genet. Genomics. 266. 546-555 (2001)
• [Publications] Johzuka, K., Horiuchi, T.: "Replication fork-block protein (Fob1) acts as a rDNA region specific recombinator in S.cerevisiae"Genes Cells. (in press). (2002)
• [Publications] 小林武彦, 竹内 靖, 定塚勝樹, 堀内 嵩: "DNA複製フォークの進行阻害と遺伝子の増幅"蛋白質核酸酵素. 46. 1004-1012 (2001)