枯草菌と大腸菌におけるトランス・トランスレーションの標的タンパク質の網羅的解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13206001
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 武藤 あきら 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (80034635)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 姫野 俵太 弘前大学, 農学生命科学部, 助教授 (80208785)
• Keywords: tmRNA / トランス・トランスレーション / タグ・ペプチド / 翻訳 / ストレス応答 / tRNA / mRNA / リボソーム

Research Abstract

tmRNAはtrans-translationにおいて標的となるタンパク質のmRNAの翻訳を自身のコードするタグペプチド(大腸菌で11アミノ酸、枯草菌で15アミノ酸)の翻訳に切り替え、その結果合成されたキメラペプチドのタグ配列を標的としてproteaseが分解する.我々は昨年度、トランス・トランスレーション反応はストレス下での菌の増殖に必要であることを明らかにしたが、本年度はその生理的役割をより明らかにするため、この反応産物を同定、解析することを試みた。His-tagを持ちしかも分解されないように(標的となるC端のアミノ酸を変化させる)変異を入れたタグペプチドをコードする変異体tmRNA遺伝子を細菌内に持ち込み発現させることにより、標的タンパク質を特異的にHis-tag:ラベルし細胞内に蓄積させ、産物をニッケルカラムを用いて精製し、His-ag抗体で検出する系を確立した.種々の生理的条件下での標的タンパク質を単離し、そのN-端のアミノ酸配列を決定しデータベースで検索することにより同定した.これまでに枯草菌で8種、大腸菌で10種の標的となるタンパク質を同定した。また、ストレス条件下では産物の量が増加すること、培養条件により標的タンパク質の種類が変わることが明らかになった。標的タンパク質の中には異化抑制に、ストレス応答、翻訳系に関わるものなど、興味深いタンパク質が含まれており、今後それらの伝子発現への関与など、生理的意味を明らかにしてゆく。さらに単離したタンパク質の酵素消化物をマススペクトル等により解析して翻訳がmRNAからtmRNAに切り替わる位置を明らかにする解析も進めている。

Research Products

• [Publications] S.Lee, M.Ishii, T.Tadaki, A.Muto, H.Himeno: "Determinants on tmRNA for initiating efficient and precise trans-translation : some mutants upstream of the tag-encoding sequence of Escherichia coil tmRNA shift the initiation point of trans-translation in vitro"RNA. 7. 999-1012 (2001)
• [Publications] K.Hanawa-Suetsugu, V.Bordeau, H.Himeno, A.Muto, B.Felden: "Importance of the conserved nucleotides around the tRNA-like structure of Escherichia coli transfer-messenger RNA for protein tagging"Nucleic Adics Res.. 29. 4663-4673 (2001)
• [Publications] A.Fujihara, H.Tomatsu, S.Inagaki, T.Tadaki, C.Ushida, H.Himeno, A.Muto: "Detection of tmRNA-mediated trans-translation products in Bacillus subtilis"Genes to Cells. 7(in press). (2002)
• [Publications] K.Hanawa-Suetsugu, H.Himeno, A.Muto: "SmpB Functions in various steps of trans-translation"Nucleic Acids Res.. 30(in press). (2002)