コンディショナルRacl欠損マウスを用いた発がんの研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13214027
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 饗場 篤 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (20271116)
• Keywords: トランスジェニックマウス / ノックアウトマウス / Rac1 / Cre / リコンビナーゼ / BAC / EGFP,転移 / ES細胞

Research Abstract

本研究では、Racの発がんおよび転移浸潤における機能をin vivoで明らかにするため、Rac1をコンディショナルにノックアウトするマウスを作成する。方法としては、rac1ノックアウトマウスをrac1染色体DNAのBACトランスジジーン(flox-rac1-EGFP Tg)でレスキューする。このマウスをRac1ヘテロ型マウス(rac1+/-)マウスと連続して交配することによって、(rac1-/-)/flox-rac1-EGFPTgマウスを作成する。このマウスにCreを作用させた細胞ではRac1が欠損すると同時にEGFPが発現する。本年度はフィーダーを必要としない胚性幹(ES)細胞にrac1ターゲッティングベクターを導入し、rac1(+/-)マウスを作成することに成功した。この系では、従来必要とされるフィーダー細胞の培養を必要とせず、ノックアウト細胞作成のための作業の簡略化ができる。さらに、Rac1BACクローンをマウス129BACライブラリーより単離し、制限酵素地図をパルスフィールド電気泳動、サザンハイブリダイゼーションにより決定した。rac1遺伝子の開始コドンの5'上流のノンコーディングエキソンにloxPを挿入したDNAをシャトルベクターに挿入し、それをBACを持つ大腸菌に導入することで、大腸菌内で、BACDNAとシャトルベクター中のDNAの間で相同組換えを生じさせ、BAC上にloxP配列を導入した。さらに、同様の方法を用いてloxP-EGFPをrac1遺伝子のpolyA付加シグナルの下流に導入し、目的のTgコンストラクト(flox-rac1-EGFP)を作成した。さらに、約100kbのflox-rac1-EGFP-DNA断片をBACベクターから分離精製し、B6受精卵にインジェクトした。現在までにflox-racl-EGFPTgを独立に4系統得た。

Research Products

• [Publications] Tabata et al.: "Control of metabotropic glutamate receptor's dynamic range by extracellular calcium"Mol. Cell. Neurosci.. (印刷中). (2002)
• [Publications] Shutoh et al.: "Loss of adaptability of horizontal optokinetic response eye movements in mGluR1 knockout mice"Neurosci. Res.. 42. 141-145 (2002)
• [Publications] Hashimoto et al.: "Roles of glutamate receptor δ2 subunit(GIuR δ2) and metabotropic glutamate receptor subtype 1 (mGluR1) in climbing fiber synapse elimination during postnatal cerebellar development"J. Neurosci.. 21. 9701-9712 (2001)
• [Publications] Maejima et al.: "Presynaptic inhibition caused by retrograde signal from metabotropic glutamate to cannabinoid receptors"Neuron. 31. 463-475 (2001)