リボザイムライブラリーを用いた細胞癌化に関わる新規分子標的の探索と細胞内機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13218025
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 川崎 広明 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (60332623)
• Keywords: 癌転移 / リボザイムライブラリー / ROCK1 / マキシザイム / RNAi / 急性前骨髄生白血病 / PML-RIARα / tRNA-shRNA発現ベクター

Research Abstract

リボザイムは、配列特異的にRNAを切断することが可能な酵素であり、癌やウイルス疾患の原因遺伝子を標的とした遺伝子治療剤としての可能性が期待されている。本研究では、基質認識部位をランダマイズしたハイブリッド型リボザイムライブラリーを用いた新規機能遺伝子探索法(ジーンディスカバリーシステム)を開発し、それを用いて新たな癌標的分子を同定することを目的としている。はじめにリボザイムライブラリーを用いたジーンディスカバリーシステムを用いて癌転移に関わる機能遺伝子の探索を試みた。その結果、細胞運動、転移に関与することが示唆されているROCK1遺伝子を標的とするリボザイムをはじめ多数の標的因子を同定し、新規機能遺伝子についても多数同定することに成功した。また、ROCK1を標的としたリボザイムは、RT-PCRの結果から確かにROCK1の発現を抑制した。それに伴い、ケモタキシスアッセイの結果から細胞運動も抑制することが確認された。さらにROCK1にはROCK2という配列や機能が類似している因子が同定されている。今回RT-PCRの結果からROCK1を標的としたリボザイムは、ROCK2の発現には影響を与えていないことがわかった。すなわち、リボザイムによる細胞の表現型に対する影響はROCK1のみの発現抑制に起因していると考えられ、ROCK1の細胞運動に対する機能の一部を解明することに成功した。
さらに癌分子標的に対する特異性を考慮した遺伝子治療剤の開発を行うためにマキザイムとtRNA-shRNA発現ベクターの検討を行った。tRNA-shRNA発現ベクターは、細胞内で効率よくRNAiを誘発することが知られている。癌分子標的としては、急性前骨髄生白血病の原因遺伝子であるPML-RARαに着目した。PML-RARα遺伝子のジャンクション部位を標的としたマキザイムとtRNA-shRNA発現ベクターを構築してPML-RARα発現細胞に導入したところ、にマキザイムとtRNA-shRNAはPML-RARα遺伝子の発現を強く抑制した。また内在性のPMLやRARαの発現には影響は見られなかったことから、PML-RARαに特異的なマキザイムとtRNA-shRNAを構築することに成功した。

Research Products

• [Publications] Reiko Onuki: "An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease"EMBO J.. 23. 959-968 (2004)
• [Publications] Hiroaki Kawasaki: "Identification of functional genes by libraries of ribozymes and siRNAs"Nucleic Acids Rea.Suppl.. 3. 331-332 (2003)
• [Publications] Keisuke Oshima: "Maxizymes and small hairpin-type RNAs that are driven by a tRNA promoter specifically cleave a chimeric gene associated with leukemia in vitro and in vivo"Cancer Res.. 63. 6809-6814 (2003)
• [Publications] Eigo Suyama: "Identification of genes involved in cell invasion by using a library of randomized hybrid ribozymes"Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.. 100. 5616-5621 (2003)
• [Publications] Hiroaki Kawasaki: "siRNAs generated by recombinant human Dicer induce specific and significant but target site-independent gene silencing in hunsan cells"Nucleic Acids Research. 31. 981-987 (2003)
• [Publications] Hiroaki Kawasaki: "Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val)promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells"Nucleic Acids Research. 31. 700-707 (2003)