脳内の時計細胞における概日リズム発振系と光入力系の分子解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13304064
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 深田 吉孝 東京大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80165258)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡野 俊行 東京大学, 大学院・理学研究科, 講師 (40272471)
• Keywords: 概日リズム / 時計遺伝子 / 位相シフト / 転写調節 / 転写抑制 / MAPキナーゼ / フォスファターゼ / リン酸化

Research Abstract

交付申請書に記載の研究目的に沿って概日リズムの発現と光位相シフトに関する研究を遂行し、以下の成果を得た。
(1)ニワトリ松果体に発現する時計遺伝子Per2, Per3, Clock, Bmall及び新規のbHLH-PAS型転写因子Bmal2をクローニングした。機能解析の結果、BMAL2はCLOCKやBMAL1と結合し、転写の促進とその抑制という両方向性の転写調節機能を持つと推定された。また、ニワトリ松果体からCry1・Cry2遺伝子を単離し、培養松果体細胞でのmRNA量を明暗・恒暗条件下で調べた。その結果、両遺伝子の発現は概日時計のみならず光の制御を受けていることが判明し、Cry遺伝子が光位相シフトに関与する可能性が示唆された。(2)ニワトリ松果体において活性が日周変動を示すMAPキナーゼ(MAPK)は主観的暗期の光刺激により脱リン酸化(不活性化)されるが、この光応答現象がMAPKを脱リン酸化するフォスファターゼの光活性化に起因することを見出した。次に、時計細胞におけるMAPKの標的蛋白質を探索し、MAPKがBMAL1をリン酸化することを見出した。このリン酸化部位を決定し、そのうちThr534のリン酸化によりBMAL1の転写活性化能が抑制されることを明らかにした。これらの結果から、MAPKの活性リズムは概日時計の位相調節に重要な役割を果たしていると考えられた。(3)光位相シフトの分子機構を知るため、Differential Display法を用いてニワトリ松果体において時刻特異的に光誘導される遺伝子を網羅的に探索した。その結果、位相後退時に発現誘導されるbZIP型の転写因子cE4BP4を同定した。転写アッセイにおいてcE4BP4はcPer2の転写を抑制し、生体においてもcE4BP4はPer2の転写を光依存的に抑制して位相後退を誘導することから、光位相シフトの重要因子と考えられた。

Research Products

• [Publications] Hirota, T: "Effect of brefeldin A on melatonin secretion of chick pineal cells."J. Biochem.. 129. 51-59 (2001)
• [Publications] Nakamura, A: "Regulatory mechanism for the stability of the meta II intermediate of pinopsin"J. Biochem.. 129. 329-334 (2001)
• [Publications] Okano, T: "Cloning of mouse BMAL2 and its daily expression profile in the suprachiasmatic nucleus: A remarkable acceleration Bmal2 sequence divergence after Bmal gene duplication"Neurosci. Lett.. 300. 111-114 (2001)
• [Publications] Hayashi, Y: "Circadian and photic regulation of MAP kinase by Ras- and protein phosphatase-dependent pathways in the chick pineal gland"FEBS Lett.. 491. 71-75 (2001)
• [Publications] Okano, T: "Photoreception and circadian clock system of the chicken pineal gland"Microscopy Reseach and Technique. 53. 72-80 (2001)
• [Publications] Yoshikawa, T: "Immunohistochemical localization of opsins and alpha-subunit of transducin in the pineal complex and deep brain of the Japanese grass lizard, Takydromus tachydoromoides."Zool. Sci. 18. 328-330 (2001)
• [Publications] Doi, M: "Light-induced phase-delay of the chicken pineal circadian clock is associated with the induction of cE4bp4, a potential transcriptional repressor of cPer2 gene."Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. 8089-8094 (2001)
• [Publications] Okano, T: "Chicken Pineal clock genes : Implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation"Genes Cells. 6. 825-836 (2001)
• [Publications] Yamamoto, K: "Chicken pineal Cry genes : Light-dependent up-regulation of cCry1 and cCry2 transcripts"Neurosci. Lett.. 313. 13-16 (2001)
• [Publications] Fukada, Y: "Circadian clock system in the pineal gland"Mol. Neurobiol.. 25. 1-12 (2002)
• [Publications] Sanada, K: "Mitogen-activated protein kinase phosphorylates and negatively regulates basic helix-loop-helix-PAS transcription factor BMAL1"J. Biol. Chem.. 277. 267-271 (2002)
• [Publications] 岡野俊行: "鳥類松果体細胞の概日時計システム"細胞工学. 20(6). 837-842 (2001)
• [Publications] 深田吉孝: "脳内光受容と体内時計の時刻調節"現代化学. 370. 24-29 (2002)
• [Publications] 松田孝彦: "タンパク質の脂質修飾.(分担執筆)『シリーズ・バイオサイエンスの新世紀』第4巻「糖と脂質の生物学」(川嵜敏祐・井上圭三 編)"共立出版. (220)201-213 (2001)
• [Publications] 深田吉孝: "光を感じる脳〜生物時計の目〜.(分担執筆)『生き物はどのように世界を見ているか』(和田勝編)"学会出版センター. (151)101-124 (2001)