魚類のC3レセプタータイプ2(CR2)の構造と機能:補体による獲得免疫の制御機構

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13460092
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 矢野 友紀 九州大学, 大学院・農学研究院, 教授 (90038266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中尾 実樹 九州大学, 大学院・農学研究院, 助手 (50212080)
• Keywords: コイ / 補体 / C3d / レセプター / CR2

Research Abstract

本研究は、硬骨魚類が哺乳類のCR2に相当するレセプターをもち、C3d-CR2の相互作用を介した免疫応答の制御機構を備えているかどうかを明らかにすることを目的とした。昨年度までに、CR2のリガンドである補体成分C3のC3dフラグメントがコイ血清中で生成されることを明らかにしたので、今年度は、レセプターの検出に必要なコイC3dフラグメントを組換えタンパク質として発現させた。C3dをコードするcDNA断片をPCRで増幅し、これをpGEX-4T-1ベクターに挿入した。これを大腸菌DH5αに導入したところ、コイC3dをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることに成功した。コイには2種の主要なC3アイソタイプ(C3-H1およびC3-S)があることが知られているが、C3-H1とC3-Sに由来する2種のC3dフラグメントを発現させ、グルタチオンをリガンドとして用いたアフィニテイーカラムクロマトグラフイーによってそれらを精製した。次に、哺乳類ではリンパ球でCR2が高発現していることを参考に、コイ末梢血からパーコール濃度勾配遠心法によってリンパ球を調製し、CR2の検出を試みた。まず、組み換えC3dで被覆した96穴マイクロプレートに対する細胞接着試験によって、C3dに対するレセプターの有無を調べたが、再現性のある結果は得られなかった。そこで、96穴プレートにリンパ球をまず接着させ、これに組み換えC3dを加えた後、抗GST抗体を用いたエンザイムイムノアッセイを行ったところ、リンパ球に対するGST-C3d組み換えタンパクの結合が検出できた。この結合は、抗コイC3抗体によって阻害された。以上の結果から、コイ末梢血リンパ球にはC3dに対するレセプターが存在することが明らかとなった。来年度は、このC3dレセプターの構造を、タンパク質および遺伝子レベルで解明する予定である。

Research Products

• [Publications] Nakao M, Matsumoto M, Nakazawa M, Fujiki K, Yano T.: "Diversity of complement factor B/C2 in the common carp (Cyprinus carpio) : Three isotypes of B/C2-A expressed in different tissues"Developmental and Comparative Immunology. 26. 533-541 (2002)
• [Publications] Nakao M, Hisamatsu S, Nakahara M, Kato Y, Smith SL, Yano T.: "Molecular cloning of the complement regulatory factor I isotypes from the common carp(Cyprinus carpio)"Immunogenetics. 54(in press). (2003)
• [Publications] Kato Y, Nakao M, Mutsuro J, Zarkadis IK, Yano T.: "The complement component C5 of the common carp (Cyprinus carpio) : cDNA cloning of two distinct isotypes that differ in a functional site"Immunogenetics. 54(in press). (2003)
• [Publications] Kono T, Fujiki K, Nakao M, Yano T, Endo M, Sakai M.: "The immune responses of common carp, Cyprinus carpio L., injected with carp interleukin-1β gene"Journal of Interferon and Cytokine Research. 22. 413-419 (2002)
• [Publications] Tomana M, Ishikawa J, Imai E, Moritomo T, Nakao M, Yano T.: "Characterization of immunoglobulin light chain isotypes in the common carp"Immunogenetics. 54. 120-129 (2002)
• [Publications] Fujiki K, Nakao M, Dixon B.: "Molecular cloning and characterization of a carp (Cyprinus carpio) cytokine-like cDNA that Shares sequence similarity with IL-6 subfamily cytokines CNTF, OSM and LIF"Developmental and Comparative Immunology. 27. 127-136 (2003)