血管平滑筋の収縮に関与する電位非依存性Caチャンネルの構造および機能の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470017
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 三輪 聡一 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40157706)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 深尾 充宏 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助手 (10250432) ; 服部 裕一 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (50156361)
• Keywords: エンドセリン / 血管平滑筋 / 収縮 / 受容体作動性カルシウムチャンネル / cDNAクローニング / アフリカツメガエル卵母細胞 / カルシウム取り込み

Research Abstract

強力な血管収縮性ペプチドであるエンドセリン-1(ET-1)による血管収縮は,主として細胞外からのCa^<2+>流入による。従来,このCa^<2+>流入経路は受容体作動性Ca^<2+>チャンネルと一括して呼ばれ,その分子実体は不明であった。我々のこれまでの研究により,生理・薬理学的には3種類のCa^<2+>透過性チヤンネルがET-1により活性化されることを明らかにしてきた。本研究では,これらの受容体作動性Ca^<2+>チャンネル分子群をコードすゑcDNAの発現クローニングを行い,それら分子の構造および機能を明らかにすることを目的とした。発現クローニングのために,アフリカツメガエル卵母細胞の微量発現系を用いて,クローン化ETタイプA受容体cDNAからin-vitroで合成したcDNAと血管平滑筋細胞から調整したmRNAを同時に発現させてスクリーニングを行う戦略を立てた。予備実験により,通常の2電極ボルテージクテンプ法をアッセイ系として用いると,ET受容体を単独に発現させた場合でも大きな内向き電流が生じるため,mRNA由来の比較的小さいCa^<2+>チャネル電流の検出がほぼ不可能であることがわかった。このET受容体により誘発される内向き電流は,細胞内ストアから動員されたCa^<2+>により活性化されるCl^-であると考えられた。そこで,細胞内で動員されたCa^<2+>と細胞外から流入するCa^<2+>を区別するために,^<45>Ca^<2+>の取り込みをアッセイ系に用いることにした。このスクリ-ニング系に用いて,血管平滑筋細胞から作製したcDNAライブラリー(初期タイター,2.0x10^6pfu)のスクリーニングを行った。その結果,ET受容体により活性化されてCa^<2+>流入を惹起するクロリンを16個単離することに成功した。現在,その構造および機能を決定しているところである。

Research Products

• [Publications] Furutani, H.: "Ca^<2+> entry channel involved in contractions of rat aorta induced by endothelin-1, noradrenaline, and vasopressin"J Cardiovasc Pharmacol. 40(2). 265-276 (2002)
• [Publications] Kawanabe, Y.: "Effects of Ca^<2+> influx through nonselective cation channel on noradrenaline-induced mitogenic responses"Eur J Pharmacol. 447(1). 31-36 (2002)
• [Publications] Kawanabe, Y.: "Molecular mechanisms for the activation of voltage-independent Ca^<2+> channels by endothelin-1 in Chinese hamster ovary cells stably expressing human endothelin_A receptors"Mol Pharmacol. 62(1). 75-80 (2002)
• [Publications] Kawanabe, Y.: "Molecular mechanism for endothelin-1-induced stress fiber formation; Analysis of G proteins using mutants of endothelin type A receptor"Mol Pharmacol. 61(2). 277-284 (2002)
• [Publications] Kawanabe, Y.: "Ca^<2+> influx through nonselective cation channels plays an essential role in noradrenalin-induced arachidonic acid release in chinese hamster ovary cells expressing α_<1A>-, α_<1B>-, or α_<1D>-adrenergic receptors"J Pharmacol Exp Ther. 299(3). 901-907 (2001)