実験的脊髄損傷に対するアデノウイルスベクターを用いた神経栄養因子の遺伝子導入

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470299
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 吉永 勝訓 千葉大学, 医学部附属病院, 助教授 (30270870)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 淳 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (20344997) ; 白澤 浩 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (00216194) ; 山崎 正志 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (50281712)
• Keywords: 脊髄損傷 / 脳由来神経栄養因子(BDNF) / アデノウィルスベクター

Research Abstract

(目的)アデノウィルスベクターを用いた神経栄養因子遣伝子導入が脊髄再生におよぼす効果を検討すること。
(方法)1.COS-TPC法を用いてβ-galactosidase (LacZ), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)の遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを作製した(それぞれAxCALacZ, AxCABDNF)。
2.COS細胞にそれぞれのベクターを感染させて培養上清を採取し、western blot法にて蛋白の発現を確認し、またニワトリ胚後根神経節を用い生物活性の有無を検討した。
3.ラット胸髄完全切断モデルを作製。脊髄断端にAxCALacZを注入し、時間経過で標本を作製、X-gal染色を行い導入遺伝子の発現動態を検討した。
4.同様のモデルにAxCALacZ, AxCABDNFを注入した。
5.損傷後6週で切断部を越えて再生した軸索を逆行性トレーサーfluorogold (FG)および順行性トレーサーbiotinylated dextran amine (BDA)にて標識した。
6.AxCALacZ, AxCABDNFそれぞれを注入した群の行動学的評価を行い比較検討した(BBB scale)。
(結果)AxCABDNF感染COS細胞上清中にはWestern blot法にてBDNFが検出され、ニワトリ胚後根神経節の神経突起伸展作用よりその生物活性が確認された。X-gal染色では、注入後1週をピークとして注入部近傍・脳幹の下降性軸索起始核(赤核・前庭核など)に陽性細胞を認めた。逆行性標識(FG)ではAxCABDNF群において赤核ニューロンの一部が標識されたが、AxCALacZ群では全く認めなかった。順行性標識(BDA)では、AxCABDNF群において切断部を越える下降性線維が認められた。
BBB scaleを用いた行動学的評価の結果、AxCALacZ群では平均スコア0.4点とほとんど改善が認められなかったが、AxCABDNF群では後肢の動きが観察され、平均スコア6.0点と有意な改善が得られた。AxCABDNF群の一部で初回切断部頭側での再切断をおこなったところ、それまでに得られた行動学的改善は失われた。
(考察)逆行性・順行性神経トレーサーの結果よりAxCABDNF注入により脳幹部からの下降性軸索の再生が得られた。AxCABDNF注入により行動学的改善が得られた方が、この改善は再切断により失われた。従って機能改善に下降性線維の再生が関与していたと思われる。
(結語)アデノウィルスベクターを用いたBDNF遺伝子導入により、下降性軸索の一部再生および後肢機能の部分的改善が得られた。

Research Products

• [Publications] Osamu Ikeda, Masashi Yamazaki, et al.: "Acute up-regulation of BDNF expression resulting from experimentally-induced injury in the rat spinal cord"Acta Neuropathologica. 102巻. 239-245 (2001)
• [Publications] Osamu Ikeda, Masashi Yamazaki, et al.: "Effects of Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on compression-induced spinal cord injury"Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 61巻2号. 142-153 (2002)
• [Publications] Masao Koda, Katsunori Yosinaga, Masashi Yamazaki et al.: "BDNF suppresses delayed apoptosis of oligodendrocytes after spinal cord Injury In rats"Journal of Neurotrauma. 19巻6号. 777-785 (2002)
• [Publications] 国府田正雄, 村上正純, 吉永勝訓, 山崎正志, 白澤浩ほか: "成ラット脊髄完全切断モデルに対するアデノウィルスベクターを用いた神経栄養因子遺伝子導入"日本整形外科学会雑誌. 76巻8号. 933 (2002)
• [Publications] Masayuki Hashimoto, Masashi Yamazaki, et al.: "Upregulation of Osteopontin Expression in Rat Spinal Cord Microglia After Traumatic Injury"Journal of Neurotrauma. 20巻3号. 287-295 (2003)