独自に開発したDNAチップを用いた発癌予測、微小転移推定、悪性度判定法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470427
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 丹沢 秀樹 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (50236775)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴原 孝彦 東京歯科大学, 歯学部, 助教授 (50178919) ; 横江 秀隆 千葉大学, 医学部・附属病院, 講師 (70261930) ; 鵜澤 一弘 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (30302558) ; 関 直彦 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助教授
• Keywords: DNAチップ / 口腔扁平上皮癌 / microarray / 転移 / 予後 / 悪性度評価法

Research Abstract

現在市販されているDNAチップは汎用チップであり、必ずしも口腔領域に適しているわけではない上に、価格が非常に高価である。そこで私達の研究グループでは口腔領域由来組織(正常粘膜、悪性腫瘍、転移リンパ節等)からRNAを抽出・精製し、cDNA libraryを作成し、それを基にして口腔領域専用DNAチップを作成した。さらに、腫瘍と正常組織における各種遺伝子の発現状況を調べた。その経過と結果を以下に記す。
1)完全長クローンの割合の高くなるオリゴキャップ法を用いて口腔領域組織におけるcDNA libraryを作成した。平均のインサート・サイズは1.6kbであった。
2)得られたcDNA libraryから96×100個のクローンを拾い出してプラスミド調整を行ない、うち、96×50個について5'末端の塩基配列を決定した。末端配列を基にクローンの帰属化を行なった結果、互いに異なる1423種類のcDNAクローンが識別された。ライブラリーの平均重複度は約3であった(1423/96×50クローン)。また、完全長cDNAクローンの割合は61%と評価された。
3)得られたcDNAクローンのインサート部分をPCR法で増幅した。これらのPCR産物とpositive controlとnegative controlをスライドグラス上にスポットした。
4)10症例について、舌扁平上皮癌と正常口腔粘膜上皮から採取したそれぞれ20μgのRNAを用いてcDNA Microarrayで検討した。その結果、腫瘍組織において増強している遺伝子と発現減弱している遺伝子が多数同定できた。特に、5倍以上の発現増強しているものが7種類、5倍以上発現減弱しているものが10種類同定できた。
5)現在、RT-PCRにより確認実験を進めている。
今後、症例数を増やすと共に、RT-PCRによる確認実験をすすめ、さらに、臨床的特徴(転移、予後、組織型等)と関連のある遺伝子を同定してゆく予定である。