2001 Fiscal Year Annual Research Report
骨芽細胞でのphosphodiesteraseの検討
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13470431
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
村田 琢 三重大学, 医学部・附属病院, 助手 (80242965)
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| Keywords | 骨芽細胞 / phosphodiesterase |
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| Research Abstract |
1.PDEの特異的阻害剤による石灰化への影響
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞MC3T3E1で各PDEの発現をRT-PCRで検討し,PDE3,4,および,8の発現を確認した.発現を認めたPDE3,4,および,8の阻害剤による石灰化への影響を検討したところ,PDE3と4阻害剤では石灰化に変化は認めなかったが,PDE8阻害剤は石灰化を抑制した.また,PDE8阻害剤で骨マーカー遺伝子発現の変化を認めた.
2.PDEのAntisenseオリゴヌクレオチドによる石灰化への影響
MC3T3E細胞よりトータルRNAを抽出後,RT-PCRにてPDE8の全長を増幅した.PCR産物をプラスミドに挿入後,大腸菌に感染させ大量培養し,プラスミドを精製した.このプラスミドにてPDE8のシークエンスを確認し,Antisenseオリゴヌクレオチドを作成した.また,PDE8に対する抗体はラビットで作成した.次に,Antisenseの効果を検討するためバキュロウイルスにてリコミナントタンパクを昆虫細胞(Sf9)で発現させウェスタンブロットで確認した.
3.PDE8遺伝子導入
上記プラスミドからPDE8A遺伝子をベクターに組込み発現ベクターを作成した.
4.PDE3Aノックアウトマウスでの骨形成の検討
海外共同研究者である米国国立衛生研究所のVincent C.Manganiello教授が作成したPDE3Aノックアウトマウスより顎骨等を摘出後,脱灰し,固定包埋した.
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