2003 Fiscal Year Annual Research Report

グリコサミノグリカン糖鎖の生合成の機作の解析と合成酵素の遺伝子操作による機能解析

Research Project

Project/Area Number	13470493
Research Institution	Kobe Pharmaceutical University
Principal Investigator	菅原一幸神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (60154449)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三上雅之神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20330425) 山田修平神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (70240017) 北川裕之神戸薬科大学, 薬学部, 助教授 (40221915) 多屋長治財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所・実験動物部門, 主任研究員 (90175456) 浅野雅秀金沢大学, 医学部, 教授 (50251450)
Keywords	コンドロイチン硫酸 / ヘパラン硫酸 / 硫酸基転移酵素 / コンドロイチン合成酵素 / コンドロイチン重合因子 / グリコサミノグリカン / ガン抑制遺伝子 / EXT
Research Abstract	ヒトガン抑制遺伝子EXTファミリーメンバーの一つEXTL2はヘパラン硫酸(HS)の生合成に関わり、コアタンパク質との結合領域四糖に最初のα-GlcNAcを転移する酵素をコードする。そのマウスホモログの細胞外ドメインを可溶性タンパク質として大腸菌で発現させ、EXTファミリーで始めてX線結晶構造解析に成功し、触媒ドメインの3つのアミノ酸を同定し、酵素反応機構を解明した。 EXTファミリーメンバーEXT1とEXT2はともにHSにGlcNAcおよびGlcAを転移し伸長反応できるが、単糖しか転移できず、これまで重合化反応は成功していなかった。今回、両酵素の遺伝子をCOS-1細胞で同時に発現させて精製し、結合領域四糖構造をもつトロンボモジュリンおよびグリピカンのコアタンパク質、あるいは人工基質を受容体として、200kDaを越える高分子ヘパランの合成に成功した。ヒトのコンドロイチン合成酵素のホモログを見い出し、cDNAをクローニングし、コンドロイチン合成酵素cDNAと共発現させ精製したものを酵素原、トロンボモジュリンやGlcA-Gal-人工アグリコンを受容体基質として、高分子コンドロイチンの重合化に成功し、コンドロイチン重合化因子と名づけた。線虫のゲノムデータベースにコンドロイチン合成酵素のオルソログを見出し、cDNAをクローニングし、GalNAcとGlcAの転移活性を確認し、二本鎖RNAを用いてRNAiを行ったところ、コンドロイチンの合成の阻害とともに細胞質分裂の阻害と細胞分裂の逆転現象を認めた。正常な培養線虫細胞から酵素的に細胞表面のコンドロイチンを除去しても同じ現象を認め、コンドロイチンが細胞分裂に必須であることを示した。コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸を合成するヒトの3種類のGalNA 4-硫酸基転移酵素をクローニングし、基質特異性の相違を明らかにした。デルマタンGalNA 4-硫酸基転移酵素-1はIdoA-GalNAc-IdoA、IdoA-GalNAc-IdoA、IdoA-GalNAc-IdoAの配列中のGalNAcに硫酸基を転移することが分かった。

Research Products

(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] Lars C.Pedersen: "Crystal structure of an α1,4-N-acetylhexosaminyltransferase (EXTL2),a member of the exostosin gene family involved in heparan sulfate biosynthesis."J.Biol.Chem.. 278(16). 14420-14428 (2003)
[Publications] 水口惣平: "Chondroitin proteoglycans are involved in cell division of Caenorhabditis elegans."Nature. 423(6938). 443-448 (2003)
[Publications] 北川裕之: "Molecular cloning of a chondroitin polymerizing factor that cooperates with chondroitin synthase for chondroitin polymerization."J.Biol.Chem.. 278(26). 23666-23671 (2003)
[Publications] 三上雅之: "Specificities of three distinct human chondroitin/dermatan N-acetylgalactosamine 4-Ο-sulfotransferases demonstrated using partially desulfated dermatan sulfate as an acceptor : Implication of differential roles in dermatan sulfate biosynthesis."J.Biol.Chem.. 278(38). 36115-36127 (2003)
[Publications] 金炳澤: "In Vitro Heparan Sulfate Polymerization : CRUCIAL ROLES OF CORE PROTEIN MOIETIES OF PRIMER SUBSTRATES IN ADDITION TO THE EXT1-EXT2 INTERACTION"J.Biol.Chem.. 278(43). 41618-41623 (2003)

2003 Fiscal Year Annual Research Report

グリコサミノグリカン糖鎖の生合成の機作の解析と合成酵素の遺伝子操作による機能解析

Principal Investigator

菅原 一幸 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (60154449)

Research Products

[Publications] Lars C.Pedersen: "Crystal structure of an α1,4-N-acetylhexosaminyltransferase (EXTL2),a member of the exostosin gene family involved in heparan sulfate biosynthesis."J.Biol.Chem.. 278(16). 14420-14428 (2003)

[Publications] 水口 惣平: "Chondroitin proteoglycans are involved in cell division of Caenorhabditis elegans."Nature. 423(6938). 443-448 (2003)

[Publications] 北川 裕之: "Molecular cloning of a chondroitin polymerizing factor that cooperates with chondroitin synthase for chondroitin polymerization."J.Biol.Chem.. 278(26). 23666-23671 (2003)

[Publications] 金 炳澤: "In Vitro Heparan Sulfate Polymerization : CRUCIAL ROLES OF CORE PROTEIN MOIETIES OF PRIMER SUBSTRATES IN ADDITION TO THE EXT1-EXT2 INTERACTION"J.Biol.Chem.. 278(43). 41618-41623 (2003)

菅原一幸神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (60154449)

[Publications] 水口惣平: "Chondroitin proteoglycans are involved in cell division of Caenorhabditis elegans."Nature. 423(6938). 443-448 (2003)

[Publications] 北川裕之: "Molecular cloning of a chondroitin polymerizing factor that cooperates with chondroitin synthase for chondroitin polymerization."J.Biol.Chem.. 278(26). 23666-23671 (2003)

[Publications] 金炳澤: "In Vitro Heparan Sulfate Polymerization : CRUCIAL ROLES OF CORE PROTEIN MOIETIES OF PRIMER SUBSTRATES IN ADDITION TO THE EXT1-EXT2 INTERACTION"J.Biol.Chem.. 278(43). 41618-41623 (2003)