組換えタンパク質分泌生産効率化のための迅速プロテオーム解析システムの構築

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13555226
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 加藤 滋雄 神戸大学, 自然科学研究科, 教授 (20026272)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 久雄 協和発酵工業(株), 工務部, 技術開発室長 ; 塩見 尚史 神戸女学院大学, 人間科学部, 助教授 (20299077)
• Keywords: 分泌生産 / α-アミラーゼ / プロテオーム解析 / リポソーム / メンブレンブロット / メタノール代謝系酵素

Research Abstract

組換え微生物によるタンパク質分泌生産は、活性タンパク質が得られ、分離も容易なためバイオ生産に広く用いられている。しかし、シグナル切断の不完全さやプロテアーゼの影響で必ずしも望みのタンパク質が高い収率で得られない。そこで、迅速測定法を用いる産生タンパク質の特性解析、細胞の生育状況の指標タンパク質ならびにプロテアーゼの測定に基づくプロテオーム解析により、分泌生産特性を的確に把握して培養制御を行い、分泌生産の効率化を図る手法を構築することした。
モデル分泌タンパク質として、α-アミラーゼ遺伝子を宿主酵母S. cerevisiaeおよびPichia pastorisに形質転換した。これらを用いてα-アミラーゼを分泌生産させ、その分泌効率に与える培養条件の検討、マーカー酵素の発現特性、ならびにC-末端部の特定領域を認識する抗ペプチド抗体を用いて、培養状態の把握と分泌タンパク質の迅速なキヤラクタリゼーションを行うことを目指した。
その結果、*Pichia pastorisを宿主とし、AOX1プロモーターをメタノールで誘導することによって、高い分泌発現効率が得られた。
*適切なメタノールの供給をDOスタットで行うことによって、高いα-アミラーゼの比分泌生産速度を達成することができた。
*抗体結合リポソームを用いるメンブレンブロット法が開発でき、迅速に発現タンパク質の測定が可能となった。
*メタノール資化代謝系酵素の活性は、メタノールによる誘導によって著しく高まり、α-アミラーゼの比分泌生産速度と関連づけられた。
*α-アミラーゼのC-末端部に対する抗ペプチド抗体を用いて、C-末端部の健全なα-アミラーゼを検出できた。
以上の結果から組換えタンパク質の効率的分泌生産システムの構築が行えた。

Research Products

• [Publications] 熊田 陽一: "Liposome Immunoblotting Assay Using a Substrate Forming Precipitate Inside Immunoliposomes"Biotechnology & Bioengineering. 80巻4号. 414-418 (2002)
• [Publications] 黒川 朋世: "Secretion of α-Amylase from Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris and Characterization of Its C-Terminus with an Anti-Peptide Antibody"Journal of Chemical Engineering of Japan. 35巻12号. 1277-1281 (2002)