かびによる有用または新規ヒドロキシ脂肪酸の発酵生産

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13556012
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 高谷 直樹 筑波大学, 応用生物化学系, 講師 (50282322)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 祥雲 弘文 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (70012036)
• Keywords: fatty acid / cytochrome P450 / hydroxylation / fermentation / screening / Fusarium oxysporum

Research Abstract

本研究は、ヒドロキシ脂肪酸の微生物による発酵生産を目的とする。具体的には、第一に、P450foxy、P450foxyの改変体、新規に探索して得られた水酸化酵素を用いた発酵生産系を確立し、既にその有用性が示唆されているヒドロキシ脂肪酸の発酵生産を試みる。第二に、基質特異性の異なる新規な脂肪酸水酸化酵素をかびよりスクリーニングし、これを発酵生産に利用する。初年度はP450foxyをモデルとした実験系の構築と新規な酵素のスクリーニングを目標とする。
(1)P450foxyの酵素学と既知の有用脂肪酸の生産。組み換え型P450foxyの様々な脂肪酸との反応性を評価した。また、反応生成物についてガスクロマトグラフ・ガスクロマトグラフ質量分析計などを用いて同定を試みた。一方、組み換え型P450foxyを用いて in vitroでヒドロキシ脂肪酸の合成に成功し、さらに現在、P450foxyを発現させた大腸菌によるヒドロキシ脂肪酸の発酵生産を試みる。
(2)酵素の機能改変。タンパク質工学的手法を用いて P450foxyの基質特異性の改変を行い、異なる種類の有用脂肪酸の生産を試みる。研究の第一段階として、P450foxyのP450ドメインと、P450 reductaseドメインをそれぞれ大腸菌で大量調整することに成功した。その結果、両ドメイン間の共有結合が、P450foxyの高い反応性に必要であることが示された。
(3)新規な有用脂肪酸生産菌のスクリーニング。新規な脂肪酸水酸化酵素活性を有するかびを自然界よりスクリーニングした。具体的には、培養した菌体の細胞内酵素活性の測定を行い選抜した。その結果、高 lipoxygenase生産性のかびを得ることができた。また、未同定の脂質を生成する活性が高いかびを複数得ることができた。