単一ヒスタミン・ニューロンからの遊離ヒスタミンのリアルタイム計測:遺伝子組替えヒスタミンオキシダーゼを用いた超微量ヒスタミンセンサの開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13557008
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 前山 一隆 愛媛大学, 医学部, 教授 (00157158)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小笠原 正人 愛媛大学, 医学部, 助手 (00325367) ; 丹羽 修 日本電信電話(株), 生活環境研究所・環境情報研究部, 主幹研究員 ; 谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
• Keywords: ヒスタミン / ヒスタミンオキシダーゼ / マイクロセンサ / オスミウム / アンペロメトリー / ヒスタミン遊離 / マスト細胞 / ラット好塩基球性白血病細胞

Research Abstract

1.ヒスタミンオキシダーゼ(HAO)の精製(前山・谷澤・小笠原):ヒスタミン・センサーの理論は、ヒスタミンが酸化酵素により酸化的脱アミノ反応を受ける時に生じる過酸化水素を測定することにある。コリネバクテリウムArthrobacter globiformisのHAOをクローニング後、そのcDNAをpET-14bベクターに組み込み、カタラーゼ非産生株の大腸菌に導入した。HAOを過剰発現させた後、ニッケルカラムを用いて24.7倍にまで精製しヒスチジンタグ標識HAO(比活性は6.56μmol/min/mg prt)を得た。
2.ヒスタミン・マイクロセンサの開発(丹羽・前山):1枚のガラス基板上に3つの薄膜炭素電極を作製し、上流側から対向電極、作用電極、参照電極とした。作用電極上に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を含むオスミウムポリマーを固定し、HAOを作用電極の上流に固定した。もう1枚のガラス基板には幅400μm、深さ100μmの流路を作製し、上記の電極基板と向かい合わせに接着し、流路の上流端、下流端にヒューズドシリカキャピラリを固定した。このマイクロセンサにシリンジポンプを接続して流速2μl/minにてサンプル溶液を吸引し、生じた還元電流をポテンシオスタットを用いて検出した。
3.肥満細胞からのヒスタミン遊離測定(前山):マスト細胞腫瘍株であるRBL-2H3細胞(0.5x10^6個/ml)をIgE抗体で一晩感作した後、抗原(DNP-BSA)、または小胞体のCa-ATPase阻害薬であるthapsigarginを添加して、ヒスタミン遊離を測定した。DNP-BSA、20ng/mlの刺激により最大反応を示した(遊離ヒスタミン濃度は2.7μM)。またthapsigargin刺激により濃度依存性にヒスタミン遊離は増加し、500nMで遊離ヒスタミン濃度は2.7μMであった。

Research Products

• [Publications] S.Iwaki: "Real-time monitoring of histamine released from rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells, with histamine microsensor using recombinant histamine oxidase"Analytical Biochemistry. (in press).
• [Publications] R.Kurita: "Differential measurement with a microfluidic device for the highly selective continuous measurement of histamine released from rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3)"LAB on a chip. (in press).