細胞周期制御因子p27Kip1の発現、代謝調節による肺癌遺伝子治療の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13557054
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 松瀬 健 横浜市立大学, 医学部・附属病院, 教授 (90199795)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 増田 道明 獨協医科大学, 医学部, 教授 (80199702) ; 五嶋 良郎 横浜市立大学, 医学部, 教授 (00153750) ; 北村 均 横浜市立大学, 医学部, 教授 (20094302) ; 寺本 信嗣 国際医療福祉大学, 保健学部, 助教授 (50282629)
• Keywords: 細胞周期制御因子 / 遺伝子治療 / 肺癌 / p27Kip1

Research Abstract

1.細胞周期制御因子p27Kip1,SKP2のcDNAのsense及びantisense adenovectorの作成(SKP2のcDNAのクローニングを含む)
RT-PCR法により得られp27Kip1のcDNAについてsense及びantisenseを真核細胞にて発現するplasmid及びadenovectorに挿入し、それぞれをE. coli及びHEK293により増殖、さらに精製し、遺伝子導入の準備を行った。同様に、RT-PCR法によりP27Kip1のdegradationを制御する蛋白をコードするSKP2についてcDNAのクローニングを行い、得られたcDNAについてsense及びantisenseをベクターを構築した。
2.p27Kip1の肺癌細胞における蓄積の機序に関する検討、及び細胞への遺伝子導入によるP27Kip1の発現量を制御することによるこれら遺伝子産物の生物学的機能解析
p27Kip1,SPK2などのcDNAを順及び逆方向に組み込み作成したplasmid及びadenovectorをA549などの肺癌由来細胞に遺伝子導入を行い、p27Kip1及びp27Kip1のdegradationを制御する蛋白の細胞内蓄積をWestern blottingにて確認し、細胞の生死及びcell cycle statusの変化などをFACS caliberにて解析の予定であり、そのため、まず刺激しない状態において、またp27Kip1をLipofection法にてplasmidを用い遺伝子導入した状態において肺癌細胞A549及び正常成人肺由来線維芽細胞HFL-1におけるp27Kip1の発現について、Western blottingにて検討を行った。またLipofection法における同細胞への遺伝子導入についてはEGFPを発現する別のplasmidを用い、蛍光顕微鏡により確認した。