表皮細胞のautocrine及びcross-induction機構阻害物質の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13557071
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 橋本 公二 愛媛大学, 医学部, 教授 (00110784)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 研志 愛媛大学, 医学部, 助手 (40294798) ; 白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320) ; 佐山 浩二 愛媛大学, 医学部, 助教授 (80187286) ; 吉野 公一郎 日本オルガノン株式会社, 医薬研究所・研究開発本部, 研究部長
• Keywords: 表皮細胞 / autocrine / HB-EGF / ADAM / MMP / 皮膚特異的ノックアウトマウス / adnovirus vector / real time PCR

Research Abstract

表反細胞のautocrineあるいはcross-induction機構におけるTGF-alpha, amphiregulin, HB-EGF, epiregulinのsheddingの役割の検討を行った。
Shedding proteaseにより切断されないHB-EGFのconstructの作成:shedding proteaseにより切断される部位(アミノ酸148-153)を置換したcDNAを作成し、keratin5 promoterの下流に組込んだplasmidを作成した。この膜型HB-EGFの発現はplasmid DNAを表皮角化細胞へ導入し免疫染色することにより蛋白が発現していることを確認した。さらに、すべての細胞で発現させるため、上記変異型DNAをアデノウィルスベクターに組み込んだアデノウィルスベクターを大量培養後、精製、透析を行い超低温層にて保存した。このアデノウィルスベクターを用いて表皮角化細胞へ感染させ、HB-EGFの発現を蛍光抗体法により確認した。
HB-EGFノックアウトマウスの作成:通常のノックアウトマウスは胎性致死であることが明かとなっているため、皮膚特異的ノックアウトマウスを作成する。Keratin 5 promoter下流にcre recombinase cDNAを組込んだ。HB-EGFの染色体の両端にLoxP配列を組み込んだ。これら2系統のマウスを作成し、現在繁殖中である。平成14年度には交配し、皮膚特異的HB-EGFノックアウトマウスが得られる予定である。
表皮細胞におけるADAM, MMPの発現の検討:adenovirus vectorの作製と、RT-PCR解析を行った。
Dominant negative ADAM9,ADAM12,constitutive active ADAM9,ADAM12のconstructを作製し、cosmid cassetteに組込み、293細胞にて相同組換えを起こさせそれぞれのadenovirus vectorを作製した。大量培養後、塩化セシウム密度勾配法にて精製し、透析した後、超低温槽にて保存した。
DAMファミリーのヒト表皮角化細胞培養系での発現。
増殖、分化刺激時の正常ヒト表皮角化細胞のADAM mRNAと蛋白質の誘導機序の検討。
ADAM mRNAの31種あるADAMのうち、プロテアーゼ活性を有することが予想される19種類についてreal time PCR用にそれぞれ特異的なTaqman probeを作製した。正常ヒト表皮角化細胞を無血清培養法で培養し、サブコンフルエントの状態に達した後にEGFを濃度を変えて添加し0、1、3、6、12、24、48時間後に細胞よりtotal RNAを抽出し、ADAMファミリーのmRNAの誘導の有無をReal time PCR法で定量的に検討した。
角化細胞においてはADAM9がメインに発現していた。

Research Products

• [Publications] Shouda T, Yoshida T, Hanada T, Wakioka T, Oishi M, Miyoshi K, Komiya S, Kosai K, Hanakawa Y, Hshimoto K, Nagata K, Yoshimura A: "Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis"J Clin Invest. 108(12). 1781-1788 (2001)
• [Publications] Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, Herlyn M: "Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development"Oncogene. 20(56). 8125-8135 (2001)
• [Publications] Hamada K, Shinomiya H, Asano Y, Kihana T, Iwamoto M, Hanakawa Y, Hashimoto K, Hirose S, Kyo S, Ito M: "Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter"Biochim Biophys Acta.. 1518(1-2). 124-131 (2001)
• [Publications] Sayama K, Hanakawa Y, Shirakata Y, Yamasaki K, Sawada Y, Sun L, Yamanishi K, Ichijo H, Hashimoto K: "Apoptosis signal regulating kinase 1 (ASK1) is an intracellular inducer of keratinocyte differentiation"J Biol Chem.. 276. 999-1004 (2001)
• [Publications] Tohyama M, Shirakara Y, Yamasaki K, Sayama K, Hashimoto K: "Differentiated keratinocytes are responsible for TNF-alpha regulated production of macrophage inflammatory protein 3alpha/CCL20, a potent chemokine for Langerhans cells"J Dermatol Sci.. 27(2). 130-139 (2001)