遺伝子導入膵ランゲルハンス島(膵島)移植の臨床応用に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13557096
• Research Institution: Clinical research Center, Chiba-East National Hospital, National Hospital Organization
• Principal Investigator: 剣持 敬 国立佐倉病院, 臨床研究部, 研究員 (50215133)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西郷 健一 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (60323424) ; 坂本 薫 国立佐倉病院, 臨床研究部, 室長 ; 山田 研一 国立佐倉病院, 臨床研究部, 部長 ; 丸山 通広 国立佐倉病院, 臨床研究部, 研究員
• Keywords: 膵島移植 / 遺伝子導入 / リポフェクション法 / リベレース / 無血清培地

Research Abstract

1.膵島への遺伝子導入法の確立:
小動物(ラット)、大動物(イヌ)から分離された膵島を用いて、1)Lipofection法(polyamine transfection reagents (Trans IT 100,Pan Vera, Co.,)またはLIPOFECTAMINE2000(LIFETECHNOLOGIES))、2)1)Gene gun法(Helios^<TM> Gene Gun (BIO-RAD))、3)Electroporation法(Gene-Pulser II (BIO-RAD))の3つの方法を検討した。遺伝子導入効率はpZeoSV2/lacZ vector (Invitrogen Co.)またはplasmid pCMS-EGFP (CLONTECH)を導入し、X-gal染色、蛍光顕微鏡観察にて判定した。
導入効率はLipofection法で94.7%(LIPOFECTAMINE2000)、92.2%(polyamine transfection reagents)と良好であり、Gene gun法では34.7%、Electroporation法では42.9%であった。ヒト膵島への導入は安全性、有効性よりLipofection法が推奨される。
2.純化酵素、無血清培地による安全な膵島分離、培養技術の開発:
本院では膵・膵島移植研究会ワーキンググループの事務局がおかれ、わが国における臨床膵島移植実施準備を進めている。臨床膵島移植実施また遺伝子導入膵島移植実現のためには安全性の高い分離、培養時術が必須である。今回純化酵素(リベレース)、無血清培地の有効性を検討した。イヌ膵よりリベレース用いて膵島を精製、無血清培地(1% ITS 加 CMRL1066)にて培養した。膵島収量、純度は4233IEQ/g、93%と良好であり、1日培養後のインスリン分泌能も良好であった。純化酵素と無血清培地の使用は、安全性の高い技術を提供し得る。

Research Products

• [Publications] 丸山通広, 剣持敬: "わが国における膵島移植の現況とその問題点"今日の移植. 15(4). 333-337 (2002)
• [Publications] 浅野武秀, 剣持敬: "糖尿病治療学の進歩「膵島移植」"日本臨床. 60(9). 636-642 (2002)
• [Publications] 剣持敬: "膵島移植(2)-わが国における取り組み"移植. (印刷中). (2003)
• [Publications] Kenmochi T: "Effectiveness of hydroxyethyl starch (HES) on purification of pancreatic islets"Journal of Surgical Research. (in press).
• [Publications] 剣持敬: "大動物臓器移植実験マニュアル"日本医学館. 214 (2003)