新世代抗体―ミニ抗体―の創製とその臨床分析化学システムへの応用

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13557224
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 順一 東北大学, 医学部附属病院, 教授 (80006337)
• Keywords: 抗体工学 / ミニ抗体 / 臨床分析化学 / ステロイド / 一本鎖Fvフラグメント / 遺伝子クローニング

Research Abstract

抗体は多岐にわたる標的抗原に対して高い特異性と親和力を示すため、臨床化学分析における機能性器材として利用価値が高い。しかし、天然の抗体には分子量が大きいこと(約15万)に起因する種々の制約がある。そこで、抗体工学の技術により天然型抗体の構造と機能を改変して、超高感度・高選択的な臨床化学分析システムの確立に有用な低分子量の抗体フラグメント(ミニ抗体)の創製を企てた。前年度に、副腎皮質ステロイドである11-デオキシコルチゾール(11-DC)及び光学活性薬物である(1R)-ブフラロールについて、臨床応用上、十分な親和力と特異性を有する一本鎖Fvフラグメント(scFv ; MW約2.5万)を調製することに成功した。そこでこの知見を基盤として、臨床診断上重要な各種ステロイド[コルチゾール、ジゴキシン、デオキシコール酸(DCA)、リトコール酸サルフェート(LCA-S)、ウルソデオキシコール酸3-サルフェート]についてscFvの調製を試みた。これらハプテンに対するマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマからRNAを抽出し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖の可変部遺伝子(V_H、V_L)をクローニングし、塩基配列を解析した。ついで、両者をリンカーペプチドを介して連結したscFv遺伝子(5'-V_H-linker-V_L-3')を構築し、大腸菌XLOLR株に発現させて可溶型scFvを調製した。これらのうち、DCA、LCA-sに対するscFvは、由来する天然型抗体に遜色のない親和力と特異性を保有することが判明した。これらscFvは酵素や蛍光タンパクなどとの融合タンパクとして調製することも可能で、各種臨床分析化学システムの構築に有用と期待される。

Research Products

• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Single-chain Fv fragments derived from an anti-11-deoxycortisol antibody. Affinity, specificity, and idiotype analysis"Steroids. 67・8. 733-742 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "A monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay of glycolithocholic acid sulfate in human urine for liver function test"Steroids. 67・10. 827-833 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Generation of a novel monoclonal antibody against cortisol-[C-4]-bovine serum albumin conjugate : application to enzyme-linked immunosorbent assay for urinary an serum cortisol"Analytical Sciences. 18・12. 1309-1314 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Idiotype-anti-idiotype-based noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay of ursodeoxycholic acid 7-N-acetylglucosaminides in human urine with subfemtomole range sensitivity"Journal of Immunological Methods. 272・1-2. 1-10 (2003)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Monoclonal anti-idiotype antibodies recognizing the variable region of a high-affinity antibody against 11-deoxycortisol. Production, characterization and application to a sensitive noncompetitive immunoassay"Journal of Immunological Methods. 274・1-2. 63-75 (2003)