2001 Fiscal Year Annual Research Report
酵素的加水分解による高生理活性キチンオリゴ糖生成システムの構築
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13650832
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
近藤 和生 同志社大学, 工学部, 教授 (30038096)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 道明 同志社大学, 工学部, 教授 (10157381)
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| Keywords | 酵素 / 加水分解反応 / 生理活性 / キチン / キチンオリゴ糖 |
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| Research Abstract |
本年度は以下の研究実績を得た。
1.キチン分解酵素の精製 アゲハチョウの蛹を70%エタノールで表面殺菌した後,pH5.5の0.1M酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液中に浸し,これをホモジナイザーで粉砕し,さらに濾過により不純物を取り除いた後,同じ緩衝液中で透析を行い,準粗酵素液を得た。これに硫酸アンモニウムを加えて70%飽和溶液とし,一晩冷蔵庫で保存した。その後,遠心分離により生じた沈殿物に緩衝液を加えて溶解させ,さらに透析により硫酸アンモニウムを除去し,最終的な粗酵素液を得た。この粗酵素液の精製をCM-Sephadexカラムクロマトグラフィー,限外濾過濃縮,ゲル濾過,限外濾過濃縮の手順により順次行った。酵素の分子量をタンパク質標品を基準にしてSDS-PAGEならびにカラムクロマトグラフィーにより推定した。同様な実験をモンシロチョウについても行った。
2.キチン分解の動力学 基質として種々の水溶性キチン誘導体を合成した。まず種々の緩衝液を用いてリゾチームを酵素とする加水分解を行い,至適pHを求めると同時に最適な緩衝液を選定した。次に至適pHに調整した緩衝液中で各種基質濃度,酵素濃度及び反応温度などの条件を種々変えて,加水分解反応を行った。反応は,生成したキチンオリゴマーのアルデヒド基によるフェリシアン酸イオンの還兀速度の測定により追跡した。次に粗酵素液ならびに精製酵素を用いて同様の実験を行い,精製酵素の特性にっいて定性的に検討した。現在,これらの実験結果を基質阻害あるいは生成物阻害を考慮した酵素反応機構により解析しているところである。同様な実験をモンシロチョウについても行った。
基質として種々の水溶性キチン誘導体を合成した。まず種々の緩衝液を用いてリゾチームを酵素とする加水分解を行い,至適pHを求めると同時に最適な緩衝液を選定した。次に至適pHに調整した緩衝液中で各種基質濃度,酵素濃度及び反応温度などの条件を種々変えて,加水分解反応を行った。反応は,生成したキチンオリゴマーのアルデヒド基によるフェリシアン酸イオンの還元速度の測定により追跡した。次に粗酵素液ならびに精製酵素を用いて同様の実験を行い,精製酵素の特性について定性的に検討した。現在,これらの実験結果を基質阻害あるいは生成物阻害を考慮した酵素反応機構により解析しているところである。同様な実験をモンシロチョウについても行った。
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