DNAセンシング用蛍光蛋白質の開発とサルモネラ属の高感度検出

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13650849
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 成田 光章 東京農工大学, 工学部, 教授 (40015102)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 裕美 (株)海洋バイオテクノロジー研究所, 釜石研究所, PD研究員 (10313305)
• Keywords: DnaA / 蛍光修飾蛋白質 / 蛍光共鳴エネルギー転移 / PCR産物 / サルモネラ属 / 蛋白質工学 / 部位特異的変異

Research Abstract

サルモネラ属検出試験は疫学的、医学的、社会学的に重要であり、PCR等の遺伝子工学的手法を利用することによりその迅速化が計られてきた。本研究では、2本鎖DNAの特異的塩基配列を認識する蛋白質を用いて、直接PCR産物を認識する極めて迅速な測定方法の開発をめざしている。検出には蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用い、結合しなかった分子を分離する作業不要な迅速な方法をめざした。そこでサルモネラ属の検出を行うために2本鎖DNAの特異的配列を認識するDnaA蛋白質を蛋白質工学により改変して蛍光修飾し、この蛋白質とPCR産物の結合をFRETで検出するシステムの開発を目的として研究を行った。本年度は実用的なアッセイ方法の構築をめざし2つのアプローチを試みた。まず、Salmonella enteritidisのDnaA蛋白質の部分配列を部位特異的変異法で改変し、蛍光修飾箇所を導入するとともに、そのN末端配列にグルタチオン-S-トランスフェラーゼと融合することにより、グルタチオン固定化マイクロプレートを用いたアッセイ方法の構築をめざした。しかしながら、本融合蛋白質は細胞内顆粒として発現することから、それらを回収し、さらにリフォールディングする必要があった。本融合蛋白質をCys導入箇所にfluorescein-5-maleimide(F5M)で修飾し、5'末端がhexachloro-6-carboxy-fluoresceine (HEX)で修飾されたSalomonella由来のOriC断片とを混合することで、F5Mの蛍光の消光が観測され、FRETがDnaA認識配列に特異的に観測できる可能性が示された。しかしながら、本融合蛋白質の調製が煩雑であり、かつ安定性が悪いことから、発現系の改良が必要である。別法として、DnaAを蛍光性蛋白質Green Fluorescence Protein(GFP)と融合蛋白質の応用を考案した。融合蛋白質は水溶性酵素として発現し、蛍光を発しさらにoriC領域への結合能力を有していたことから、融合蛋白質のoriC領域への会合体形成に伴う蛍光変化を指標としたアッセイ系の基盤が構築できた。

Research Products

• [Publications] K.Sode, S.Igarashi, A.Morimoto, H.Yoshida: "Construction of Engineered Water-soluble PQQ Glucose Dehydrogenase with Improved Substrate Specificity"Biocatalysis and Biotransformation. 20(6). 405-412 (2002)