蛍光共鳴エネルギー転移を利用したセンサーペプチドの創成

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13650852
• Research Institution: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 横山 憲二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助教授 (80242121)
• Keywords: MAPキナーゼ / フルオレセイン / ローダミン / FRET / リン酸化 / 固相合成

Research Abstract

分裂促進物質活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)カスケードは真核生物の重要な情報伝達経路である。そのため、これらの挙動をイメージングにより解析することは極めて重要となっている。本研究ではリン酸化で起こるペプチドの立体構造変化に着目し、その立体構造変化により蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が変化するようにセンサーペプチドを設計、合成した。
センサーペプチドの配列は、MAPKキナーゼによりリン酸化されるMAPKの配列(HTGFLT__-EY__-VAT,下線のチロシンとトレオニンがリン酸化される)を用いた。まず、GHTGFLTEYVATGCを固相上に合成し、N末端α-アミノ基にRhodamine B(Rho) sulfonylchlorideを修飾した。次にクリベージを行い、Rho-GHTGFLTEYVATGCを得た。次にシステイン側鎖にFluorescein (Flu)-5-maleimideを修飾し、逆相HPLCにより精製した。Rho-GHTGFLTEYVATGC(Flu)の合成確認は、MALDI-T0F MSで行った。同様にリン酸化センサーペプチドRho-GHTGFL[pT]E[pY]VATGC(Flu)を合成した。次に、リン酸緩衝液中、励起波長450nm(Fluの励起波長)でセンサーペプチドの蛍光スペクトルを測定した。その結果、センサーペプチドはリン酸基の有無により異なる蛍光スペクトルを示した。センサーペプチドは、リン酸化されるとFluの蛍光が増加し、FRETによるRhoの蛍光が減少した。これはリン酸化によりペプチドの立体構造が変化したことでFRETが起こりにくくなったためと考えられる。このリン酸化による蛍光スペクトル変化から本研究で設計したセンサーペプチドはキナーゼ活性測定ができるセンサーとしての可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] K Yokoyama, M Matsumoto, H Ishikawa, Y Morita, E Tamiya: "Sensor peptides bazed on fluorescence resonance energy transfer"Advances in Biochemical Production Technologies, ACS Symposium Series. (印刷中).
• [Publications] Y Morita, Y Murakami, K Yokoyama, E Tamiya: "Synthesis and analysis of peptide ligand for biosensor application using combinatorial chemistry"Advances in Biochemical Production Technologies, ACS Symposium Series. (印刷中).
• [Publications] 森田資隆, 金原健, 村上裕二, 横山憲二, 民谷栄一: "チップ技術と連携したコンビナトリアル設計法による機能分子の創成"生物工学会誌. 79. 367-370 (2001)
• [Publications] K Yokoyama, T Sakai, H Ishikawa, Y Morita, E Yamiya: "Screening and design of hybrid peptide that binds with glucose oxidase"Peptide, The Wave of the Future, Proceedings of the Second International and the Seventeenth American Peptide Symposium. 202-203 (2002)
• [Publications] 横山憲二: "バイオセンサーからDNAチップまで"化学と教育. 49. 786-787 (2001)
• [Publications] K Yokoyama, S Koide, Y Kayanuma: "Cyclic voltammetric simulation of electrochemically mediated enzyme reaction and elucidation of biosensor behaviors"Analytical and Bioanalytical Chemistry. 372. 248-253 (2002)
• [Publications] 民谷栄一, 森田資隆, 村上裕二, 横山憲二: "バイオセンサー-新規バイオセンサー創成に向けてのチャレンジ-,化学フロンティア5・生命科学のニューセントラルドグマ"化学同人. 275 (2002)