蛍光共鳴エネルギー転移を利用したセンサーペプチドの創成

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13650852
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)
• Principal Investigator: 横山 憲二 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオニクス研究センター, 副研究センター長 (80242121)
• Keywords: プロテインキナーゼA / EDANS / DABCYL / 蛍光共鳴エネルギー転移 / リン酸化 / 固相合成

Research Abstract

蛍光エネルギー転移によるクエンチングを利用した、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の活性をイメージングするためのペプチドの設計を行った。本センサーペプチドは、リン酸化されることによって親水性が高くなり、立体構造変化を起こし、蛍光強度が変化すると考えられる。具体的には、Kemptide配列(LRRASLG)を含む種々のペプチドを用いて、このペプチドのC末端に蛍光ドナーとして、EDANSを、N末端にクエンチャーとして、dabcylを修飾したペプチドを合成した。
合成によって得られた非リン酸化及びリン酸化センサーペプチドの蛍光スペクトルを測定した結果、リン酸化センサーペプチドの蛍光強度は、非リン酸化ペプチドより大きく、顕著な差が見られた。これは、センサーペプチドがリン酸化されることによって、親水性が高くなり、ペプチドが伸びたような構造をとるために、蛍光色素間の距離が離れ、エネルギー転移が起こりにくくなったためであると考えられる。一方、塩基性アミノ酸を伸長させたペプチドでは、反対にリン酸化により蛍光強度が小さくなった。これはリン酸化により、電荷が中和され、それゆえ縮んだ構造になるためであると考えられる。また、PKA反応後のセンサーペプチドのHPLCの溶出時間は、合成によって得られたリン酸化センサーペプチドの溶出時間と一致し、本センサーペプチドは、PKAによってリン酸化されることが確認された。

Research Products

• [Publications] Shu Taira, Kenji Yokoyama: "DNA-conjugated polymers for self-assembled DNA chip fabrication"Analytical Science. 20. 267-271 (2004)
• [Publications] Shu Taira, Kenji Yokoyama: "Self-assembly DNA-conjugated polymer for detection of Single Nucleotide Polymorphism"Biotechnology and Bioengineering. 印刷中. (2004)
• [Publications] 横山 憲二: "蛍光センサーペプチド"Medical Science Digest. 29. 550-553 (2003)
• [Publications] 樺山 憲二: "プロテインチップ開発の現状"バイオベンチャー. 3. 24-27 (2003)