細菌の熱センサータンパク質-シャペロン転写制御タンパク質HrcAの機能解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660097
• Research Institution: Kyoto Prefectural University
• Principal Investigator: 渡部 邦彦 京都府立大学, 農学部, 助教授 (90184001)
• Keywords: HrcA / 熱センサー / 熱ショック / シャペロン

Research Abstract

(1)熱ショックのin vitroシュミレーションによるHrcA-DNA複合体の熱安定性の調査
His-tagをN末端に付加した形で大腸菌で発現させ、金属アフィニテイクロマトグラフィで精製したHrcAを用いて、溶液系での様々な温度でのHrcAタンパク質の変性を光散乱光度分析により調べた。その結果、CIRCEを含むプラスミドpTY-1が共存すると、HrcAタンパク質は複合体を形成して可溶化されることが判った。この複合体は、元株であるBacillus thermoglucosidasius KP1006の至適生育温度付近以下(60℃)では安定に存在したが、その温度を超えると急激に安定性を失うことが判った。また中温菌Bacillus subtilis由来のHrcAを同様に調べると、生育温度を越える50℃で凝集が生じることが判った。このことは、HrcAが生育温度を境に、複合体が破壊され熱ショック応答のスイッチが入るというモデルを裏付ける結果である。
(2)HrcAタンパク質のDNA結合領域の特定
HrcAタンパク質の一次構造から高次構造予測を行い、DNA結合モチーフであるHelix-Turn-Helixを特定した。これらの配列は、他の起源のHrcAについても良く保存されていた。そしてこの中に含まれかつ保存性の高い塩基性アミノ酸Lys31とArg43に注目し、それぞれPro及びAspに置換した変異タンパク質(K31P及びR43D)を作成し、精製した。これら2つの変異タンパク質と野生型タンパク質のCIRCE結合能をゲルシフト分析法で比較した。K31P及びR43Dは、それぞれ1/3、1/16にHrcAタンパク質との結合能を低下させていることが判り、これら2つの残基がある領域が、CIRCEとの結合に重要であることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Kunihiko Watanabe et al.: "Renaturation of Bacillus thermoglucosidasius HrcA repressor by DNA and thermostability of the HrcA-DNA complex in vitro"Journal of Bacteriology. 183. 155-161 (2001)
• [Publications] M.Okamoto et al.: "A thermostable collagenolytic protease with a very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp. strain MO-1"Applied Microbiology and Biotechnology. 57. 103-108 (2001)
• [Publications] Kunihiko Watanabe et al.: "Identification of catalytic and substrate-binding site residues in Bacillus cereus ATCC7064 oligo-1,6-glucosidase"Biosci. Biotechnol. Biochem. 65. 2058-2064 (2001)
• [Publications] Kunihiko Watanabe et al.: "Oligo-1,6-glucosidase from a thermophile Bacillus thermoglucosidasius KP1006 was efficiently produced by combinatorial expression of GroEL in Escherichia coli"Biotechnology and Applied Biochemistry. 35. 35-43 (2002)