ラン藻由来の光合成炭素還元系に関わる新規酵素の立体構造と反応機構の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660098
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 西村 勁一郎 大阪府立大学, 先端科学研究所, 教授 (70026558)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 多田 俊治 大阪府立大学, 先端科学研究所, 助教授 (70275288)
• Keywords: ラン藻 / FBPase / SBPase / 結晶化 / X線構造解析 / 異常分散 / 放射光 / セレノメチオニン

Research Abstract

目的酵素を大腸菌(BL21(DE3)pLysS)を用いて発現し、各種クロマトグラフィーにより精製した。湿重量約2gの大腸菌から精製酵素として12.5mgを得た。先に確立した方法により結晶化し、回折X線測定を大型放射光施設・SPring-8において液体窒素温度下で行い、分解能2.2Åデータを得た(独立反射数59500、収率88.7%、Rmerge11.6%)。位相を異常分散法で決定するため、本酵素のSe-Met置換体をMet要求性の大腸菌(B834(DE3)pLysS)を用いて発現した。LB培地で前培養した大腸菌を、Se-Metを添加した最小培地でさらに培養し、OD_<600>値が0.5〜0.6になったところでタンパク質発現の誘導剤を添加した。誘導の12時間後に集菌し、各種クロマトグラフィーで精製した。この方法により、湿重量約2gの大腸菌から精製酵素として9.3mgを得た。純度の検定はSDS-PAGEで行い、目的酵素に由来する単一バンドを示すことを確認した。精製酵素を用いて結晶化条件の検索を行った結果、ネイティブ酵素とほぼ同じ条件で柱状の結晶を得た。Seの異常分散効果を利用した回折X線測定は、SPring-8において液体窒素温度下でセレン原子の異常分散効果を利用して行い、4種の波長でのデータを得た(分解能2.5AÅ)。位相の決定はプログラムSOLVEを用いて行い、得られた電子密度図から、非対称単位に一個の四量体が存在することが明らかとなった。現在、重原子同型置換法を併用して位相の改良を行うため、重原子誘導体結晶の調製条件について検討を進めている。

Research Products

• [Publications] Y.Nakamura et al.: "Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the fructose-1, 6-/sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase of Synechococcus PCC 7942"Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 57・3. 454-456 (2001)