原核と真核生物由来のキメラ型スクアレン環化酵素による非天然型天然物の創製

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660105
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 星野 力 新潟大学, 農学部, 教授 (30165542)
• Keywords: スクアレン / ラノステロール / ホペン / Alicycobaccilus acidocaldarius / キメラ型酵素 / 部位特異的変異

Research Abstract

平成13年度で得られた知見を以下に列挙する.
1.キメラ型酵素を作成するにあたり、まずスクアレンーホペン環化酵素の部位特異的変異実験により、非天然型トリテルペンが創製されるかどうか検討した.
(1)Tyr495, Tyr612及びTyr609をAlaへ置換し、速度論解析を行った.これらチロシン残基の役割として、D377やF365の機能(カチオン中間体の安定化)の補助作用を担うことを明らかにした(Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2233-2242, 2001).
(2)Tyr420やLeu607を大きなパルクサイズへ置換したところ、従来見い出されてない非天然型トリテルペンを創製する事に成功した(Biosci. Biotechnol. Biochem 投稿中).
2.オキシドスクアレン環化酵素として典型的な豚肝臓ミクロソームに存在するラノステロール合成酵素の基質認識機構の基礎的知見を得る為 10-エチルオキシドスクアレンを合成し、その環化生成物を同定した.多段階の環化反応が単環性化合物で反応が停止した.その際、環化が従来知られていた椅子型でfoldingされず、舟形で折り畳まれ、また3S-オキシドスクアレンしか反応しないと考えれていた酵素認識が、 10-位にわずかにパルキーな置換基が導入されることにより、3R-体も酵素反応する事を明らかにした(Tetrahcdron Lett.,42, 7319-7324, 2001)
3.遺伝子工学的な手法でキメラ型酵素を作成する為、Canndida allbicans由来のラノステロール合成酵素遺伝子を取得した。現在ホペン合成酵素とこのラノステロール合成酵素のキメラ型酵素作成が遣伝子操作を行い進行中である.

Research Products

• [Publications] Tsutomu Sato, Tsutomu Hoshino: "Catalytic function of the residues of phenylalanine and tyrosine conserved in squalene-hopene cyclases"Biosci. Biotechnol. Biochem. 65・10. 2233-2242 (2001)
• [Publications] Tsutomu Hoashino, Yoshiyuki Sakai: "Enzymic products of the 2, 3-oxidosqualene analog having an ethyl residue at 10-position. First trapping ofthe trimethylcyclohexanone ring by lanosterol synthase"Tetrahedron Lett.,. 42. 7319-7324 (2001)
• [Publications] Tsutomu Hoshino, Tsutomu Sato: "Squalene-hopene cyclase: catalytic mechanism and substrate recognition"J.Chem. Soc. Chem. Commun.. issue 4(印刷中). (2001)
• [Publications] Watanabe, Y et al.: "A novel sphingophosphonolipid head group 1-hydroxy-2-aminoethyl phosphonate in Bdellovibrio stolpii"Lipids. 36. 513-519 (2001)
• [Publications] 星野 力: "スクアレン環化酵素-解明されつつある活性部位・触媒機構"バイオサイエンスとインダストリー. 59・3. 167-170 (2001)