2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13660330
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| Research Institution | Nippon Institute for Biological Science |
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Principal Investigator |
岩田 晃 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 主任研究員 (70193745)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金井 朋子 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 研究員 (10300790)
山元 哲 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 研究員 (40290986)
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| Keywords | イヌ / パルボウイルス / 治療 / CDR移植 / イヌ化 / 中和 / モノクローナル抗体 |
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| Research Abstract |
本課題ではイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体を「イヌ化」し、試作抗体を用いてイヌパルボウイルス感染症を治療することを目標としている。今年度はイヌ化抗体を設計・作製するために必要な「部品」の準備を行った。
1.パルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体を作製し、抗体タンパク質をコードするcDNAクローンを単離した。
(1)イヌパルボウイルスを培養し、超遠心法で精製した。これを抗原としてマウスに免疫し、脾臓細胞を用いて細胞融合を行った。
(2)ハイブリドーマを感染細胞を用いた間接蛍光抗体法、また、精製抗原を用いたELISAでスクリーニングし、最終的に中和活性を有する6クローンを単離した。
(3)樹立したハイブリドーマ株よりIsogen^<TM>を用いてRNAを抽出し、5´raceを行って5´端の塩基配列を決めたあと、特異プライマーを用いていLA-PCRによりlmmunoglobulin(lg)Light、Heavy両鎖のmRNA全長を増幅した。PCR断片をベクターにクローニングした。
2.イヌの抗体をコードするcDNAクローンを得る。
(1)イヌ脾臓細胞を調製し、試験管内で2μg/ml LPS存在下で培養した。継時的に培養上清を調製し、イヌ抗体の生産を抗体(Bethyl社)を用いてウエスタンブロツティングで確認した。lgM、lgG2の発現が認められた。培養後の細胞よりmRNAを調製し、発現ライブラリーを作製した。
(2)すでに基礎免疫を行っているビーグル犬にパルボウイルスを感染させ、脾臓細胞よりRNAを調製した。lg lambda、kappa鎖断片の塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、本RNAを鋳型としたRT-PCRで増幅を確認した。本断片をベクターにクローニングし、塩基配列を確認した。
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