有害微生物のDNA検出のための新規ジンクフィンガー蛋白質の創出

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660339
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture & Technology
• Principal Investigator: 池袋 一典 東京農工大学, 工学部, 助教授 (70251494)
• Keywords: ジンクフィンガー / 有機微生物検出 / PCR産物 / ファージディスプレイ / 2本鎖DNA検出 / 蛍光偏光法 / Zif268

Research Abstract

平成13年度に2本鎖DNAの特異的塩基配列を直接検出できるジンクフィンガー蛋白質Zif268をファージディスプレイにより調製した。ジンクフィンガーモチーフを形成させるために必要な、亜鉛イオンに配位するアミノ酸配列の部分は保存し、塩基配列を認識するフィンガー部分を改変させることにより日本に於ける食中毒の主な原因菌であるinvA遺伝子中の連続した9塩基配列を認識するジンクフィンガー蛋白質を探索する事を試みたが、これまで報告された変異等を導入しても高い結合能を示す新規ジンクフィンガー蛋白質を作製することはできなかった。
そこでPCR産物のような2本鎖DNAを簡単迅速に検出できる方法として、ジンクフィンガー蛋白質提示ファージを用いて蛍光偏光法により蛍光標識2本鎖DNAを検出することを試みた。その結果Zif268提示ファージを用いれば、Zif268の認識配列GCGTGGGCGをもつ合成2本DNAを瞬時に選択性良く検出できることが見いだされた。蛍光偏光法は特定の分子同士の結合を溶液の中で直接観察できる方法であり、結合していない分子等を分離する作業を要しない最も簡単な検出法の一つである。サルモネラなどの有害微生物は高感度かつ迅速に検出する必要であるが、最も一般的に使われている効率の良いPCRにより増幅した標的遺伝子配列を含む2本鎖DNAをジンクフィンガー蛋白質により溶液中で混合しただけで瞬時に検出できる事が可能になり、本方法は最も簡単な微生物検出法としてその応用範囲は極めて広いと考えられる。

Research Products

• [Publications] Kazunori Ikebukuro: "Amperometric DNA sensor using the pyrroquinoline quinone glucose dehydrogenase -avidin conjugate"Biosensors and Bioelectronics. 17(11-12). 1075-1080 (2002)
• [Publications] Kazunori Ikebukuro: "Electrochemical DNA sensor using genetically engineered thermostable pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase"Electrochemistry. (accepted). (2003)