MRSA複合感染を伴うウイルス感染症の防御に関する基礎研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670141
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 奥宮 明子 神戸大学, 医学部, 助教授 (10107948)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小西 英二 神戸大学, 医学部, 助教授 (40135786) ; 片岡 陳正 神戸大学, 医学部, 助教授 (80071398)
• Keywords: プロテアーゼ / ウイルス / カリクレイン / プラスミン

Research Abstract

研究実施計画 1.精製酵素によるウイルス活性化作用の解析
血漿カリクレイン、トリプトシン、プラスミン、トロンビン、トリプターゼのウイルス活性化作用を検討した。血漿カリクレインはヒト血漿を原材料として、PKSI527-アフィニテイクロマトグラフィにより精製し(研究発表1)、高純度の血漿カリクレイン標品を得た。トリプトシン(牛、Mochida)、プラスミン(ヒト、Chromogenix)、トリプターゼ(Cortex)は市販の精製酵素標品を用いた。
センダイウイルス活性化作用の検討のために、抗ウイルス抗体を用いた免疫染色測定法を確立した。プロテアーゼと37℃で10分間作用させたセンダイウイルスを、confluentに培養したLIC-MK2細胞に感染させ、抗センダイウイルス血清を用いてAvidin-Biotin-Peroxidase法により感染細胞の数を測定した。
本方法により、トリプシン、プラスミン、血漿カリクレインにセンダイウイルス活性化作用が見られた。トロンビン(50〜100u/ml)は弱いながらセンダイウイルス活性化作用を示したが、トリプターゼには用いた濃度(0.1^〜5μg/ml)では活性化作用は見られなかった。
研究実施計画2.黄色ブドウ球菌培養液中のプロテアーゼの合成基質分解およびこれに対する各種インヒビターによる阻害スペクトルの解明
この目的のために黄色ブドウ球菌を培養し、培養濾液の酵素活性を合成ペプチド基質(pNAおよびMCA基質)を用いて測定した。菌株を変えても検討したが、現在、まだ酵素活性を検出できていない。カゼインーZymographyも試みたが、この方法でも培養濾液の酵素活性は検出できなかった。

Research Products

• [Publications] 1.Tada M, tsuda Y, Wanaka K, Hijikata-Okunomiya A, Hone N, Okamoto U, Okamoto S, Okada Y: "Isolation of plasma kallikrein by highly efficiency affinity chromatography and its characterization"Biol Pharm Bull. 24(5). 520-524 (2001)
• [Publications] 2.Tomoo K, Satoh K, Wanaka K, Okamoto S, Hijikata-Okunomiya A, Okada Y, Ishida T: "Binding diversity of a noncovalent-type low molecular weight serine protease inhibitor and function of a catalytic water molecule : X-ray crystal structure of PKSI-527-inhibited trypsin"J Biochem. 129. 455-460 (2001)