染色体変化の腫瘍内多様性からみたゲノム変化のtemporal analysis

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670171
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 杉原 洋行 滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (30171169)
• Keywords: 腫瘍 / 染色体 / CGH / DOP-PCR / リアルタイムPCR

Research Abstract

これまでに、microdissectionの比較的容易な食道扁平上皮癌を用いて、病変ごとに多数箇所サンプリングし、HUMARAによる単クローン性の証明、DOP-PCR CGHによる初期の染色体変化の抽出を行い、国際誌に発表した。しかし、DOP-PCRで増幅・標識したDNAと増幅せずnick translation(NT)で標識したDNAとの間で、CGHの結果に微妙に差がみられた。
この差の原因を解明するために、まず、これまでにpainting FISHとCGHで絶対的なコピー数の明らかにした培養系を用いて、腫瘍細胞に見られるDNAのコピー数の増減が、DOP-PCRで増幅する過程、あるいは標識の過程で変化してしまわないかどうかを検討した。
その結果、標識方法の影響が大きく、DOP-PCR後にNT標識をすればPCR増幅せずにNT標識をした場合とCGHの結果はほとんど変わらないがPCR標識ではartifactが増えることがわかった。また、リアルタイムPCRでPCR増幅のphase間(exponentialかplateauか)でCGHの結果を比較したところ、有意な差は見られなかった。そのために以後の検討はplateau phaseまでDOP-PCRを行いNTで標識することにした。その条件下で、培養細胞と正常細胞、またはDNA-diploidの培養細胞とDNA-tetraploidの培養細胞を種々の割合で混合してDOP-PCRで増幅したものとしなかったものとの間でCGHの結果を比較した。現在データの解析を行っている。この方法論の検討と平行して、細胞単離の困難さからこれまでほとんどデータのない、未分化型の胃癌の組織切片から、laser capture microdissectionで得られた微小組織をDOP-PCRで増幅、NTで標識してCGHを行い、最近ようやくデータが出始めた。これで、原発腫瘍に応用できる準備が整ったと考えている。この応用が平成14年度の目標である。

Research Products

• [Publications] 杉原洋行: "CGHの定量的解析:Interphase karyotypingへの試み"Cytometry Research. 11・1. 1-7 (2001)
• [Publications] Kamitani S: "Intratumoral regional variations in copy number of chromosomal part revealed by microdissection and combined ploidy and comparative genomic hybridization analyses in esophageal squamous cell carcinoma"Cancer Genetics and Cytogenetics. 132. 30-35 (2002)
• [Publications] Tamura H: "Clonal analysis of esophageal squamous cell carcinoma with intraepithelial component"Pathobiology. (in press).