ジフテリア毒素レセプターの細胞外領域を切断するプロテアーゼのクローニング

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670287
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 馬田 敏幸 久留米大学, 分子生命科学研究所, 講師 (30213482)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三浦 芳樹 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (90279240)
• Keywords: ジフテリア毒素レセプター / HB-EGF / LPA / 膜結合型メタロプロテアーゼ / 細胞外領域の切断

Research Abstract

研究代表者は血小板由来のリゾフォスファチジン酸(LPA)がジフテリア毒素レセプター/膜結合型HB-EGF前駆体(DTR/HB-EGF)の細胞外領域の切断を誘発することを見い出した。これまでに数種類の既知の膜結合型メタロプロテアーゼのドミナントネガティブフォームを発現させた細胞で、LPA誘発によるDTRの切断は阻害されなかった。このことから、新規の膜結合型メタロプロテアーゼの関与が示唆されたのでこれをクローニングし、その活性化されるメカニズムを解明するために研究を行っている。
昨年度は下記の3方向から研究を進めた。
1 DTRとアソシエートする分子からのクローニング
2 メタロプロテアーゼ阻害剤により濃縮される分子からのクローニング
3 DTRの切断を阻害するモノクローナル抗体からのクローニング
2については阻害剤を失活させずに担体にカップリングする条件の探索が困難を極め、停止状態である。また3については数十クローンをスクリーニングしたが、DTRの切断を阻害するクローンは得られていない。よって、1の方法にて研究を続行中である。進捗状況は、LPA刺激で切断が起きないミュータントDTRを発現する細胞を作製し、LPAで刺激した後、細胞表面特異的にケミカルクロスリンクをかけた。可溶化してHB-EGFのN末端抗体で免疫沈降をしたところ、複数の蛋白が共沈澱することが分かった。そこで各蛋白質のペプチドシーケンスを行うに足りうるだけの量を集めるために、大量培養を行った。共沈降した蛋白質は還元してクロスリンカーを切断し、遊離させた。この溶液のゲルろ過を行い、HPLCにかけ、シーケンスを行った。しかし主に読まれるのはDTRか抗体のフラグメントであった。
そこで、ゲルろ過前の溶液を酸化した後、DTRと抗DTR抗体の各フラグメントを各々抗DTR抗体と抗IgG抗体によって吸収した。この溶液を上記方法により、シーケンスを試みている。

Research Products

• [Publications] Takenobu T., Yamazaki A., Hirata M., Umata T., Mekada E.: "The Stress-and the Inflammatory Cytokine-induced Ectodomain Shedding of HB-EGF is mediated by p38 MAPK, distinct from TPA-induced signaling cascades"J. Biol. Chem.. (in press).