造血幹細胞への遺伝子導入による慢性関節リウマチモデルマウスの治療

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670470
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 簔田 清次 自治医科大学, 医学部, 教授 (30211593)
• Keywords: リンパ球 / 造血幹細胞 / 遺伝子治療 / 慢性関節リウマチ / ケモカインレセプター

Research Abstract

造血幹細胞への遺伝子導入の臨床応用に向けてまず末梢リンパ球への遺伝子導入を今年度は試みた。マウスの脾臓から取り出したリンパ球への遺伝子導入は、マーカー遺伝子としてGFPを発現するレトロウイルスを用い、フローサイトメトリーでのGFP陽性細胞の割合により導入効率を評価した。これまではマウスのリンパ球への遺伝子導入効率はレトロウイルスを用いた場合、最高でも10%程度であったが、抗CD3、抗CD28抗体を含んだ組換えファイブロネクチンを用いてプレートをコートし、この上でリンパ球へのウイルス感染を繰り返すことにより、マーカー遺伝子のGFP陽性細胞を30%以上に上げることができた。これにより導入リンパ球をソートしなくても、導入細胞を体内に戻すことが容易になった。関節局所に細胞を選択的に集積させる遺伝子の候補として、ケモカインレセプターを選択した。ケモカインレセプターとマーカー遺伝子を1つのレトロウイルスベクターに組み込み、2種の蛋白を発現するベクターを作製した。ケモカインレセプターに対する抗体は市販されているものが少ないため、タグ蛋白を発現するFLAGタグ塩基配列をケモカインレセプター遺伝子の前に組込み、FLAGタグ蛋白結合ケモカインレセプターとして発現させ、タグ蛋白を確認することにより、レセプターの蛋白レベルでの発現の確認とした。マウス造血系培養細胞へ遺伝子導入後、細胞蛋白抽出液からの抗FLAG蛋白抗体を用いた免疫沈降、ウエスタンブロッティング法にて、蛋白レベルでレセプターが発現していることが確認できた。今後は、培養細胞で発現されたケモカインレセプターが機能するかを確認するため、対応するケモカインにて実際に遊走するかをvitroで確認し、その後にマウスの体内へ戻し、関節の炎症個所に選択的に遊走するかを確認する予定である。

Research Products

• [Publications] Nagashima, T., Hirata, D., Yamamoto, H., Okazaki, H., Minota, S: "Antineutrophil cytoplasmic autoantibody specific for proteinase 3 in a patient with shunt nephritis induced by gemella morbillorum"Am. J. Kidney Dis.. 37. E38 (2001)
• [Publications] Kuraiwa, K., Arai, Y., Okazaki, H., Minota, S., Tominaga, S: "Identification of human ST2 protein in the sera of patients with autoimmune diseases"Biochem Biophys Res Commun.. 284. 1104-1108 (2001)
• [Publications] Ikeda, U., Shimpo, M., Ikeda, M., Minota, S., Shimada, K: "Lipophilic stains augment inducible nitric oxide synthase expression in cytokine-stimulated cardiac myocytes"J. Cardiovasc Pharmacol.. 38. 69-77 (2001)
• [Publications] Hojo, Y., Ikeda, U., Ohya, K., Ichida, M., Kario, K., Takahashi, M., Ikeda, M., Minota, S: "Interaction between monocytes and vascular endothelial cells induces adrenomedullin production"Atherosclerosis. 155. 381-387 (2001)
• [Publications] Horie, S., Minota, S., Kano, S: "Large macrophage colony-forming cells in peripheral blood of patients with collagen vascular diseases : high occurrence among patients with systemic sclerosis and dermatonyositis"J. Rheumatol. 27. 2378-2381 (2000)
• [Publications] Mimori, A., Suzuki, T., Nakajima, K., Masuyama, J., Yoshio, T., Kano, S., Minota, S: "Clinical features of dermatomyositis in the presence or absence of malignancy"APLAR J. Rheumatol.. 3(3). 217-220 (2000)